【求助】180KD的膜蛋白western转膜条件怎样？（湿转）
丁香园论坛
6219
鄙人现在做一180KD的蛋白，之前转PVDF膜用的是100v两个半小时，预染marker转得很漂亮，内参也很不错，但是目标蛋白条带却没有，请教各位大侠，这是什么原因？还有诸位大蛋白转膜时候条件怎样？我用的是湿转，谢谢
我觉得100V2h肯定是足够了，没转上应该是你目的蛋白的问题，可能是蛋白表达量太少或者你提蛋白的时间有问题。
350 mA恒流转2小时就足够了，目标条带没有有很多原因，比如会不会是抗体问题等。
第一考虑表达量的情况。建议测量标本中的含量。
第二考虑抗体的问题。
第二考虑抗体的问题。
用的是细胞株，一抗用的是CST的，说明书上面图倒是还不错，链接的已发表文章图也不错，之前有两次WB目的蛋白倒是出了条带，不强，而且个别细胞株分为两层条带，但是当时背景没有洗干净，最近一次背景洗干净了，目的蛋白也没有了，之前看到的会不会是降解的或者杂质？
可能是降解的或者杂质
100v 2h
可以看看抗体的抗原表位是不是和你的目标蛋白一致，如果抗体特异性没有问题，也许是目标蛋白表达量比较低，可以试试加大上样量，做几个浓度梯度看看。
一般我都是60v过夜湿转，同样180kd的EGFR结果很好，对于这种分子量较大的蛋白我都是过夜的，还有用百分之八或十的胶来跑电泳，如果还是不出结果就要考虑抗体了
是否考虑了PVDF膜的孔径？（0.22 or 0.45?)
本文由丁香园论坛提供，想了解更多有用的、有意思的前沿资讯以及酷炫的实验方法的你，都可以成为师兄的好伙伴
师兄微信号：shixiongcoming
