膜蛋白的纯化实验

一、膜的制备

从细胞或组织中分离质膜是纯化膜蛋白的第一步。由于缺少能有效分离去污剂增溶的膜蛋白的生化方法，因此在质膜成分纯化上投人一些时间会对后续步骤的结果有利。

大多数膜蛋白的含量较低, 因此选择易于大量获取并能高表达目的膜蛋白的组织或细胞系就很重要。最近，人们对于将细胞表面蛋白质作为鉴定不同细胞系或干细胞的标示物的研究兴趣逐渐增加。而作为其影响之一, 如何从有限数量细胞中获取足量的细胞膜 ，并能较好富集质膜标示物的酶活性，已经成为膜分离领域新的关注点。

制备细胞膜成分需要打碎组织或细胞，最 常 用 的 方 法 是 用 杜 恩 斯 勻 浆 器（Douncehomogenizer)将组织或细胞在等渗的蔗糖缓冲液中(0.25m d /L ，p H 7〜8)匀菜。膜蛋白整合在细胞膜内时相对比较稳定。而细胞破碎时可能会释放蛋白酶，因此蛋白质水解导致的失活是膜纯化过程中最需要考虑的问题。商业上有方便的片剂形式提供的蛋白酶抑制剂的鸡尾酒式混合剂，如完全蛋白酶抑制剂鸡尾酒式混合剂[complete protease inhibitor Cocktail (R o c h e ,Indianapolis，I N )]。 膜蛋 白的胞外结构域直接接触氧化环境 ，并且大部分的巯基都以二硫键形式存在，这些二硫键都是蛋白质在内质网中加工时形成的。因此, 还原剂在这一步骤中也许不需要。实际上，高浓度的还原剂会改变现存二硫键的构象 ，导致膜蛋白酶活性失活或配体结合活性丧失。由于二硫键结构和糖基化修饰, 相对而言 ，膜蛋白的胞外结构域对蛋白质水解具有较高的抵抗性。然而也有例外。例 如 ，Ca〜依赖的细胞黏附分子C a d h e r m s ，当 C a 2+ 被 E D T A 除去时易受蛋白质水解。相反，介导膜
蛋白信号转导的胞内区通常易被蛋白质水解。如胰岛素受体，如果在匀浆和后续膜分离步骤中没有足够量的蛋白酶抑制剂，其受体酪氨酸激酶活性将会极大的丧失。

最常用的膜分离方法采用差速离心和蔗糖密度梯度离心的组合。由于脂质和蛋白质组成上的差异，细胞膜具有不同的密度使其可与其他细胞器分离。差速离心可以从细胞勻浆中去除可溶性蛋白质、大部分的线粒体和细胞核。蔗糖密度梯度可进一步分离不同密度的细胞膜。然 而 ，多步离心过于冗长并且只能获得质膜的一小部分。一般许多质膜在较早的离心步骤中丢失。因此，这种方法更适合于从较易获取的组织中分离细胞膜。在生化研究中，大鼠的肝脏就是最常用于分离细胞质膜的组织之一。已经有了很多从大鼠肝脏中分离不同膜成分的方法。 Neville( 1%8)使用的方法是在低渗溶液中勻浆肝脏，随后采用不连续的蔗糖梯度离心，这种方法能够非常好的回收肝脏质膜并且已经得到了广泛应用。

在只使用少量组织培养细胞的情况下，需要增加质膜蛋白的回收率的同时不牺牲膜的纯度。亲和基质提供了一种简单快速的膜纯化方法。传统的琼脂糖或丙烯酰胺亲和基质不能用于分离细胞膜，因为它们会沉淀相对密度高的细胞器(如细胞核）。化学方法处理的磁珠可与多种蛋白质偶联, 这已经成为了亲和基质的一种新形式。与传统的琼脂糖或丙烯酰胺亲和基质不同，磁珠能够用磁铁方便的从混合物中分离出来，因此可用于分离细胞器并且与细胞器的密度无关。只需简单地将装有磁珠的离心管靠近磁铁, 磁珠即可在离心管中接近磁铁的一端被回收, 从而轻易地从混合物中分离出来。因 此 ，磁珠可作为离心的替代方法。这一性质对于将质膜与其他细胞器分离会具有很大优势。我们最近用固定凝集素的磁珠从培养的上皮细胞中纯化出了膜蛋白（Leeetal. ,2008)。这个步骤利用了以下事实，即一些膜蛋白是糖基化的并且能够结合凝集素—糖 结 合 蛋 白 在 这 一过程中，生物素化的凝集素伴刀豆蛋白A(concanavaIin A ,ConA)与链霉亲和(streptavidin)磁珠相结合, 从而将ConA固定于磁珠。带有ConA的磁珠与匀浆的细胞裂解液混合 ，磁珠在离心管的一端被回收，从而将与磁珠不结合的其他细胞器去除。 5’核酸酶是一个膜蛋白，与前列腺PC-3细胞或宫颈HeLa细胞总的细胞裂解物相比，它的活性在ConA的磁珠回收后得到了增强，从而表明细胞膜与ConA磁珠有结合。凝集素磁珠方法的一个缺陷是，我们无法使用竞争性糖a-甲基甘露糖(alpha-methyl mannoside)将细胞膜从ConA磁珠上洗脱下来。这可能是因为竞争性的糖不能进人细胞膜和ConA磁珠之间的结合位点。因此，我们使用去污剂将膜蛋白从ConA磁珠上溶解下来。利用去污剂增溶
膜蛋白会在本章第3 节中介绍。

二、天然膜蛋白的增溶

膜蛋白嵌人脂双层中。整合膜蛋白至少有一段蛋白质序列嵌入细胞膜中，而外周蛋白则通过静电相互作用或某些情况下通过疏水相互作用与细胞膜相联系。用高盐或高p H 溶液司以从膜上解离外周膜蛋白（Schindler et aL ,2006), 如 0•5m o l / L N a C l 。由于这一过程中不使用去污剂, 外周膜蛋白可以用与可溶蛋白质类似的方法纯化。

在纯化前，整合膜蛋白需要从脂双层中增溶出来，从而成为单独的蛋白质。具有两亲性 (amphipathic)的去污剂通常用于从细胞膜中增溶整合膜蛋白。去 污 剂 也 许 可 分 为 3种类型: 离子型、非离子型和兼性离子型（zwitterionic)。 本 书 第 4 1 章讨论了去污剂的不同类型。因此，接下来我们只讨论去污剂在膜蛋白纯化方面的应用。

去污剂处理后的细胞膜在105 000 g 、4°C 离 心 I h 后, 如果膜蛋白在上清液部分，则认为膜蛋白从细胞膜中「溶解」出来了。去污剂溶解膜蛋白的这一过程可被分为几个阶段 。第一阶段，去污剂结合细胞膜。随着去污剂含量的增加, 去污剂开始裂解细胞膜。去污剂含量的进一步增加会导致形成脂质/蛋白质/去污剂的复合物。这 时 ，膜蛋白被「溶解」。此时还需要额外的去污剂将上述复合物「脱脂Y d e U p k k t e )为蛋白质/去污剂复合物和脂质/去污剂复合物 。 一 般来说，去污剂和蛋白质的比例为1 〜 2 时就足以将膜蛋白溶解为脂质/蛋 白 质 /去 污 剂 复 合 物 ，比 例 为 1 0 左 右 或 更 高 时 会 导 致 复 合 物 的 脱 脂
(Hjelmeland,1990)。对 于 特 定 的 膜 蛋 白 , 溶 解 膜 蛋 白 的 最 佳 去 污 剂 和 蛋 白 质 比 例 需 要 通过 实 验 确 定 。

去 污 剂 的 选 择 可 以 简 单 地 表 述 为 选 择 能 够 对 目 标 蛋 白 质 起 作 用 的 去 污 剂 。非变 性 去污 剂 能 够 增 溶 膜 蛋 白 而 并 不 使 其 失 活 或 功 能 丧 失 。在 可 供 选 择 的 去 污 剂 中 ， Triton X— 100、胆酸钠(sodium cholate)、C H A P S 、辛基葡糖昔(octylglucoside)在 大 多 数 情 况 下 是 非 变
性 」的 ，虽 然 在 溶 解 过 程 中 会 损 失 一 部 分 的 活 性 。

去污剂的存在会在多个方面影响蛋白质的纯化。去污剂会影响蛋白质活性的检测，如去污剂会影响细胞膜转运蛋白的转运活性，而对受体来说，去污剂则会影响其配体结合活性。由于蛋白质不再与细胞膜联系在一起，测量转运活性需要将可溶膜蛋白重组合到磷脂囊泡中。并且对于特定的受体，也需要能将没有结合的配体从配体-受体复合物中分离出来的方法。这些要求也许会限制增溶时使用的去污剂类型。例 如 ，如果后续需要将膜 蛋 白 重 组 合 到 磷 脂 囊 泡 中 ，则 应 该 使 用 具 有 高 临 界 胶 束 浓 度 的 去 污 剂（胆 酸 钠 、C H A P S 、辛基葡糖苷），因为它们更易通过透析方法去除。

一 些类型的去污剂会干扰 蛋 白 质的某些检测。聚氧乙烯的衍生物，如 Triton X-100、C 12E 9和 t w e e n 系列会在考马斯亮蓝0 2 5 0 染料结合测量(又被称为Bradford检测）中产生假阳性(Bradford, 1976) 。 而胆酸钠或脱氧胆酸钠会在Bradford测量中产生沉淀。Triton X-100和 NP-40在 280 nm波长处有吸收从而会在色谱中干扰紫外线吸收方法监测洗脱蛋白质。这需要改变蛋白质检测方法或选择与蛋白质检测方法兼容的去污剂。双金鸡宁酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白检测方法（Smith et al. ,1985)可兼容某些去污剂 。有一种基于Lowry蛋白质检测法(Peterson,1977)的改良方法，通过脱氧胆酸盐和三氯乙酰酸(trichloroacetic acid，T C A )首先将蛋白质从溶液中沉淀出来，这能够避免去污剂的干扰并可在整个纯化过程中测量蛋白质的浓度。然而，改良的Lowry法 与 Bradford法相比需要花费较长的时间。

某些情况下，去污剂的纯度非常重要。例如，去污剂中的杂质会干扰X 射线结构分析或质谱分析。聚氧乙烯衍生物，如 Tnton X-100、 LubroI PX、tween、Brij系列包含了各种长度的聚合物并且在化学上是不均一的。而辛基葡糖苷、十二烷基麦芽苷和CHAPS则具有非常明确的化学组成，可以得到相对高的纯度。非离子型去污剂，包括如Triton X-100和 tween系列的聚氧乙烯衍生物，在离解蛋白质复合物方面没有离子型去污剂有效, 但许
多蛋白质在非离子去污剂中更稳定。

筛 选 能 够 溶 解 整 合 膜 蛋 白 的 去 污 剂 ，必 须 首 先 辨 别 那 些 能 够 增 溶 但 不 失 活 膜 蛋 白 的去 污 剂 。在 满 足 这 些 要 求 后 ，还 需 要 考 虑 其 他 因 素 , 包 括 与 蛋 白 质 检 测 、鉴 定 和 层 析 方 法的 兼 容 性 。去 污 剂 与 各 种 层 析 方 法 的 干 扰 将 会 在 本 章 第 4 节 讨 论 。

筛 选 去 污 剂 时 ，需 要 制 备 如 I mg/mL特 定 蛋 白 质 浓 度 的 细 胞 膜 组 分 ，随 后 加 人 0. 2〜20 mg/m L 不 同 浓 度 的 去 污 剂 溶 液 。通 常 在 去 污 剂 /蛋 白 质 的 比 例 为 0•1〜 10(w/w) 时能 够 发 生 增 溶 。溶 液 在 〇 〜 4°C孵 育 3〇〜60 min, 随 后 4°C 、105 000 g 离 心 I h 。接下 来 在上 清 液 和 沉 淀 中 检 测 目 标 蛋 白 质 的 活 性 。如 果 大 部 分 的 活 性 出 现 在 上 清 液 中 ，则 说 明 此去 污 剂 适 合 该 膜 蛋 白 。如 果 活 性 在 上 清 液 中 没 有 出 现 而 出 现 在 沉 淀 中 ，则 此 去 污 剂 不 能从 细 胞 膜 中 溶 解 出 该 蛋 白 质 或 去 污 剂 加 入 的 量 不 够 。而 如 果 活 性 在 上 清 液 和 沉 淀 中 都 没
有检测到，则此去污剂使目标蛋白质失活。

三、膜蛋白的纯化

一 旦 使 用 了 合 适 的 去 污 剂 将 膜 蛋 白 从 细 胞 膜 中 増 溶 出 来 ，就 可 以 分 离 目 标 蛋 白 质 了 。传 统 色 谱 层 析 技 术 ，如 凝 胶 过 滤 、亲 和 、离 子 交 换 和 层 析 聚 焦 （chromatofocusing)等 都 可以 用 于 膜 蛋 白 纯 化 。然 而 ，在 去 污 剂 存 在 条 件 下 使 用 色 谱 层 析 需 要 注 意 以 下 几 点 。

(1) 使用足量的去污剂，以维持整合膜蛋白在缓冲液中处于可溶形式并防止蛋白质聚集。

(2) 由于大多数去污剂具有疏水性，基于蛋白质疏水性的蛋白质分离方法，如苯基-琼脂糖凝胶和反相层析也许不适于膜蛋白的纯化。

(3) 增溶膜蛋白的离子型去污剂，如胆酸盐或脱氧胆酸盐，不适用于离子交换层析。非离子型或兼性去污剂则可用于基于电荷的制备技术, 包括离子交换层析和制备电泳。

(4) 含糖基的去污剂也许会干扰特定的凝集素层析，如 辛 基 葡 糖 苷 会 干 扰 ConA层 析 。

(5) 由于溶解的膜蛋白处于去污剂胶束中，在凝胶过滤中膜蛋白具有更大的表观分子质量。能形成大分子质量胶束的去污剂，如 Trtion X-100, 会使溶解的膜蛋白的分子质量 增 加 60〜100 kDa。因此, 大多数蛋白质会出现在高分子质量部分，从而使基于分子大小的蛋白质分离变得困难。

(6) 膜蛋白与去污剂胶束的结合，特别是具有大胶束尺寸或本身为离子型的去污剂，会遮蔽膜蛋白的电荷。因此，离子交换层析分离膜蛋白的能力也许不如非膜蛋白。

(7) 整体而言，亲和层析是目前纯化整合膜蛋白最有用和最成功的方法, 并且在各个纯化阶段都能使用。由于离子交换层析对缓冲液的离子强度敏感，而凝胶过滤要求相对小体积的浓缩样本, 因此亲和层析可以用于纯化、浓缩以及在不同层析步骤中进行盐置换 。几种常用的膜蛋白纯化的亲和层析方法将在下面的部分中阐述。

4.1 凝集素亲和层析

有 3 种类型的亲和层析分别使用一般配体(如凝集素）、特异性配体(如酶抑制剂、激素)和抗体。固定的凝集素是亲和层析的常见形式。凝集素是糖结合蛋白，可用于快速并温和地纯化质膜糖蛋白。凝集素-糖的相互作用可逆并且可以被单糖抑制。由于膜蛋白常常是糖基化的，因此凝集素层析对于纯化膜蛋白非常有用。 目前已经鉴定了大量的凝集素 ，其中使用最广泛的是ConA[结合右旋甘露糖ct(crI> mannose)]和麦胚凝集素[germ
agglutinin, 结合唾液酸和乙酰氨基葡萄糖(3(sialic acid and ^ I> GIcNAc)]。这里需要提及使用凝集素亲和层析的几个方面。首先 ，目标蛋白质是否能够与特异的凝集素结合需要实验验证。由于不同的组织具有不同的糖基化酶，有时在相同动物的不同组织表达的同一糖蛋白也许会具有不同的凝集素结合特异性。其 次 ，特定的凝集素的亲和层析纯化的是一组具有特定糖基化类型的糖蛋白，因此并不能达到配体或抗体亲和层析方法达到
的纯化程度。最 后 ，凝集素对特定类型的去污剂敏感。虽然非离子型去污剂，如 Tritonx -100(可 至 2. 5 % ，m /V )对 C o n A 或麦胚凝集素配体结合活性的影响可以忽略，但一些离子型去污剂，如 S D S 也许会失活凝集素。

下面是一个使用凝集素柱纯化膜蛋白的实验方案范例。

(1) 转 移 2 mL麦胚凝集素(WGA)-琼脂糖到一 次性的塑料柱子(PolyPrep，Bio-RadLaboratories) 中 ，清 洗 WGA-琼 脂 糖 亲 和 基 质 。用1〇 mL 清 洗 缓 冲 液 [50 mmol/LH E P E S ( p H 7. 〇 、0.1 % 去污剂]充满柱子，让洗液流过柱子以除去未结合的W G A 和保存缓冲液。

(2) 在溶解的细胞膜提取物中加入清洗过的WGA-琼脂糖。在室温转动或振荡器上振 荡 3〇 min, 使 WGA-琼脂糖和可溶细胞膜提取物混合。

(3) 600 r/m in 离 心 I m in 以沉淀 WGA-琼脂糖。用移液管吸出上清液。加 入 1〇倍体积(基于WGA-琼脂糖的体积)的洗液，颠倒数次。

(4) 重复步骤(3)两次。

(5) 加 人 2 m L 洗液到W G A -琼脂糖，再 将 W G A -琼脂糖移回柱子。用 5〜10倍柱体积的洗液清洗。定时进行蛋白质检测，如用考马斯亮蓝蛋白质检测方法直到蛋白质水平降至背景值，即与洗液中蛋白质水平相似。

(6) 加人一半柱体积的洗脱缓冲液, 如5〇 mmol/L H E PE S(PH 7. 4)、0. 1 % 去污剂、0•25m 〇I/L N -乙酰氨基葡糖, 从W G A -琼脂糖上洗脱糖蛋白。收集洗脱部分。

(7) 加人一半柱体积的洗脱缓冲液, 收集洗脱部分。

(8) 重复步骤(7)4次。

(9) 检测洗脱液中的蛋白质浓度。例如, 从每份洗脱液中吸出5 pL 并用考马斯亮蓝方法检测蛋白质浓度。将适当的部分汇集在一起。

4.2 配 体 亲 和 层 析

配体亲和层析成功的关键是配体和受体的亲和要足够强，能够允许纯化步骤中的结合和清洗。配体通常通过偶联固定到亲和基质（affinity support)上 。由于去污剂的存在 ，配体(或抑制剂）和受体的亲和性也许会被改变。因此, 如果使用配体亲和柱纯化, 关键在于选择不会显著降低受体和配体亲和活性的去污剂。

4.3 抗 体 亲 和 层 析

如果有可用的抗体，则使用特定膜蛋白的固定化抗体是纯化膜蛋白最有力的方法。抗体在非离子型去污剂中相对比较稳定，因此能够与溶解的细胞膜制备物中的去污剂兼容 。困难在于从免疫亲和柱上洗脱膜蛋白（ 详 见 第 2 8 章）。

四、去污剂的去除和置换

如果将去污剂完全去除，大多数膜蛋白会聚集并沉淀。因此，为了保持膜蛋白的功能 ，在去除一种去污剂的同时通常会引入另一种去污剂。在一些情况下, 如在起始增溶阶段 ，样品中过量的去污剂会干扰蛋白质的活性和浓度测量，这时需要去除过量的去污剂。在 另 一 些 情 况 下 ，用 于 增 溶 的 起 始 去 污 剂 也 许 不 适 于 后 续 的 层 析 或 分 析 步 骤 ，有 必 要 置 换为 另 一 种 去 污 剂 。例 如 ，离 子 型 去 污 剂 与 离 子 交 换 层 析 和 等 电 聚 焦 不 兼 容 ，需 要 将 其 置 换为 非 离 子 或 兼 性 去 污 剂 。如 果 膜 蛋 白 需 要 重 组 合 到 磷 脂 囊 泡 中 ，需 要 改 为 具 有 高 临 界 胶束 浓 度 的 去 污 剂 , 从 而 可 以 通 过 透 析 方 法 除 去 去 污 剂 而 使 膜 蛋 白 重 组 合 到 磷 脂 囊 泡 中 。去 污 剂 是 否 容 易 去 除 与 其 性 质 具 有 很 大 关 系 。高 临 界 胶 束 浓 度 (>1 mmol/L) 的 去 污 剂 ，如 胆 酸 盐 和 辛 基 葡 糖 苷 ，透 析 或 超 滤 就 能 轻 易 去 除 。低 临 界 胶 束 浓 度 (<1 mmol/L) 的去污 剂 ，如 非 离 子 型 去 污 剂 Triton X-100、C12E9 、Brij、Tween，很 难 通 过 透 析 去 除 ，可 以 使用 层 析 基 质 吸 附 、凝 胶 过 滤 、平 衡 的 方 法 。去 污 剂 的 去 除 和 置 换 方 法 见 第 4 1 章 。

五、重组整合膜蛋白的表达和纯化

蛋 白 质 结 构 研 究 或 为 了 生 产 针 对 膜 蛋 白 的 抗 体 ，通 常 需 要 表 达 和 纯 化 重 组 的 整 合 膜蛋 白 以 获 得 足 量 蛋 白 质 。膜 蛋 白 通 常 采 用 哺 乳 动 物 细 胞 或 昆 虫 细 胞 表 达 。信 号 序 列 对 于将 蛋 白 质 靶 定 到 内 质 网 非 常 重 要 ，它 会 影 响 蛋 白 质 的 合 成 和 翻 译 后 的 修 饰 。 因 此 ，标 签 通常 加 在 序 列 末 端 以 避 免 影 响 蛋 白 质 的 膜 靶 向 过 程 。有 时 ，来 自 其 他 蛋 白 质 的 信 号 序 列 被
用 于 提 高 膜 靶 向 的 效 率 。小 的 标 签 ，如 His6 标 签 或 短 肽 标 签 ，不 会 给 蛋 白 质 带 来 很 大 的改 变 ，还 能 提 高 异 源 细 胞 表 达 膜 蛋 白 的 概 率 。金 属 亲 和 层 析 具 有 高 亲 和 能 力 且 不 受 去 污 剂的 影 响 ,Xt 于 表 达 和 纯 化 膜 蛋 白 来 说 是 一 个 好 的 选 择 。其 他 亲 和 表 位 标 签 ，如 FLAG、 Myc或 H A 也 能 使 用 。然 而 ，用 固 定 抗 体 纯 化 蛋 白 质 能 力 有 限 并 且 成 本 比 金 属 亲 和 层 析 高 得 多 。

多 篇 文 献 中 都 可 找 到 表 达 和 纯 化 膜 蛋 白 的 例 子 。一 个 例 子 是 用 昆 虫 细 胞 表 达 和 纯 化细 胞 黏 附 分 子 CEACAMKPhanetaL ,2001)。在 这 个 研 究 中 ，被 表 达 的 整 合 膜 蛋 白 C 端有 一 个 7 个 组 氨 酸 的 标 签 并 采 用 了 原 始 信 号 序 列 ，结 果 发 现 重 组 的 CEACAM1 蛋 白 定 位于 细 胞 膜 。细 胞 被 裂 解 后 用 Triton X- 1 0 0 溶 解 细 胞 膜 ，并 用 金 属 亲 和 层 析 一 步 纯 化 带His 标 签 的 CEACM1 。