IgA的纯化
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IgA 的纯化
血清中IgA的含量较低,一般从乳汁中提取分泌型IgA。
【材料和试剂】
(1)人初乳Xml。
(2)生理盐水(NS),HCl。
(3)2mol/L Tris,0.1mol/L pH6.3 PB。
(4)0.01mol/L, pH7.5(含0.1mol/L NaCl)和0.01mol/L,pH7.7(含0.25mol/L NaCl)的PB。
【操作步骤】
(1)取Sephadex G-200 25g,经蒸馏水充分膨胀后,以0.01mol/L,pH6.3的PB平衡并装柱,柱床体积为2.5cm×100cm。
(2)将10ml NS缓慢加入初乳中,混匀,43000r/min 4℃离心60min。
(1)吸出中层乳清液,以1mol/L HCl调至pH4.0,4℃ 24000r/min离心30min。
(2)吸取上清以2mol/L Tris 调至pH7.3,同上离心,取上清,以0.45μm硝酸纤维素膜过滤。
(3)收集滤出液过Sephadex G-200层析柱,以0.01mol/L,pH6.8 的PB低温洗脱,0.3~0.5ml/min,分部收集,并以紫外监测仪280nm监测。
(4)第一峰以IgM为主,第二峰为IgA,第三峰为IgG,收集合并第二峰各管,装入透析袋中。
(5)对0.01mol/L,pH7.5(含0.1mol/L NaCl)的PB透析4~6h。
(6)过DEAE-Sephadex A-50柱,以0.01mol/L,pH7.5(含0.1mol/L NaCl)的PB洗脱至OD 280nm< 0.02。
(7)改用含0.25mol/L NaCl的PB洗脱,分部收集,280nm测蛋白峰,收集合并含蛋白的洗脱峰,浓缩后置-20℃保存。