天一湖医者
最近在提细菌膜蛋白做SDS-PAGE电泳,用的是超速离心法,膜蛋白用10mM的Tris缓冲液(ph 7.0),2%Trintionx-100溶解。每孔80ug左右蛋白做SDS-PAGE电泳却看不到条带。我原来是加sds加样缓冲液跟样品煮3min,但是发现沉淀较多,后来没有煮,直接跑电泳,考马斯亮蓝染色,但是结果都一样,没有条带,只在胶的底部看到很多smear一样的东西。我估计是膜蛋白溶解性太差的原因。哪位战友能帮我想办法解决这个问题?
dxywode
先做个western确定下目标蛋白是否表达? 因为膜蛋白表达量教低,即使过量表达也只有1mg/l 甚至更低 SDS检测不到很正常。 保证每步都加PMSF或者相应蛋白酶抑制剂 避免被降解。换表面活性剂。不同膜蛋白适用的表面活性剂不同 参考文献的选择吧。不过没有参考的话 一般DDM是优先选择的。尤其对于a-helix膜蛋白。
府宅
可以试一试用8M 尿素溶解,也可以用TCA 沉淀
whilt-shirt
膜蛋白不能煮,直接加loding上样,上样前在用移液枪吹打均匀
bamboopiggy
加loading后煮10min,改为40ug/孔上样,感觉是你蛋白没有裂解好。并且上样量太大了
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