关于膜蛋白SDS-PAGE电泳？

天一湖医者

2022-03-22

最近在提细菌膜蛋白做SDS-PAGE电泳，用的是超速离心法，膜蛋白用10mM的Tris缓冲液（ph 7.0)，2％Trintionx－100溶解。每孔80ug左右蛋白做SDS-PAGE电泳却看不到条带。我原来是加sds加样缓冲液跟样品煮3min，但是发现沉淀较多，后来没有煮，直接跑电泳，考马斯亮蓝染色，但是结果都一样，没有条带，只在胶的底部看到很多smear一样的东西。我估计是膜蛋白溶解性太差的原因。哪位战友能帮我想办法解决这个问题？

4 个回答

dxywode

2022-03-24

有帮助

先做个western确定下目标蛋白是否表达？因为膜蛋白表达量教低，即使过量表达也只有1mg/l 甚至更低 SDS检测不到很正常。保证每步都加PMSF或者相应蛋白酶抑制剂避免被降解。换表面活性剂。不同膜蛋白适用的表面活性剂不同参考文献的选择吧。不过没有参考的话一般DDM是优先选择的。尤其对于a-helix膜蛋白。

府宅

2022-03-23

有帮助

可以试一试用8M 尿素溶解，也可以用TCA 沉淀

whilt-shirt

2022-03-23

有帮助

膜蛋白不能煮，直接加loding上样，上样前在用移液枪吹打均匀

bamboopiggy

2022-03-23

有帮助

加loading后煮10min，改为40ug/孔上样，感觉是你蛋白没有裂解好。并且上样量太大了