IgM的纯化
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大多数IgM类抗体是优球蛋白不溶于水,故可用双蒸水透析纯化IgM。对那些溶于水的IgM类抗体可用饱和硫酸铵沉淀。沉淀后可以采用颗粒排斥层析法(凝胶过滤)进一步纯化。
颗粒排斥层析(size-exclusion chromatography)法又称分子筛层析或凝胶过滤,是利用微孔凝胶分离不同大小分子的抗体,可用于样品中IgG和IgM的分离,常用于对硫酸铵粗提物的进一步纯化。通过该法纯化所得抗体可用于Ig分子片段的制备、FITC、生物素或同位素标记。
一、材料和试剂
1. 抗血清,杂交瘤腹水或其上清,硫酸铵沉淀粗提γ球蛋白。
2. 含0.02%NaN3 的硼酸缓冲液,PBS。
3. 透析袋;26mm×900mm层析柱。
4. 适当筛孔的颗粒排斥(SE)凝胶(AcA Ultragel-或Sephacryl S-200(Pharmacia LKB)。
5. 蛋白透析、SE层析和SDS-PAGE所需的其他试剂和器材。
二、操作步骤
1. 待提取样品11,000~13,000r/min(15,000~20,000×g),4℃或室温离心,除沉淀。
2. 上清液对双蒸水透析4℃24h。
3. 11,000~15,000r/min 4℃ 或室温离心1h,留沉淀。
4. 制备SE凝胶层析柱,以硼酸缓冲液平衡。
5. 将步骤3沉淀或饱和硫酸铵粗提γ球蛋白以3~5ml硼酸缓冲液溶解,缓慢加样。
6. 以硼酸缓冲液洗脱蛋白质,并收集100管(每管为柱床体积的1%),IgM在洗脱液的第一个蛋白峰。
7. 收集Ig蛋白峰,分别合并,透析浓缩,紫外分光光度计OD 280nm测定Ig含量,SDS-PAGE鉴定IgM纯度。
8. 以1~20mg Ig/ml硼酸缓冲液置4℃或-70℃保存。