【求助】western

各位好：我做了1个多月western blot了，内参跑得还可以，但是目的蛋白总是跑不好，今天跑出来非特异性条带很清楚，而目的条带却很淡，不知是什么原因！前一次也是这种情况，我就延长封闭时间至2h，一抗1:700，二抗1:5000，请各位高手帮忙分析一下吧！下面是我的图片，最下面，模糊的一条（靠图片中间的一条）是我的目的条带！

如果非特异带很清楚，延长封闭时间没作用。你的目的蛋白和一抗的关系是什么，这点很重要。分析了这点之后，如果显色时间在1分钟之内，目的带可能是特异带。确信下面的带是特异的，建议换一抗，换其他封闭液。

目的蛋白和一抗的关系是什么?我不明白这事什么意思啊，我的目的蛋白RAC1蛋白啊，一抗是兔抗大鼠RAC1多克隆抗体啊！

目的蛋白是在什么宿主细胞里表达的？

哦，是大鼠平滑肌细胞上表达的！

是天然蛋白吗？

我不明白天然蛋白是什么意思，我的RAC1蛋白 是细胞自己合成的，我是用刺激因子刺激后检测RAC1蛋白表达的变化！

各位高手： 最近我加大了上样量，得到一个图片还是不怎么好！下面的一条是我的目的改进啊条带，可是怎么那么窄啊，我还应该怎么改进啊？ 帮帮忙啊！