【求助】western blot

请教高手我最近做western blot，结果总是不理想，目的条带总是很淡，上样量已经是60ug了，封闭用的是5%脱脂奶粉，我还应该怎么改进哦？下面是我的结果，采用的是ECL化学发光，凝胶成像系统拍照，下面一条是我的目的条带。 麻烦各位帮帮忙吧！

转膜应充分，并提高第一抗体的使用量！

用好点的抗体

我觉得你首先应拿一个别人已经做过western blot证实条带条件好的蛋白样本来做对比，排除你在做western操作过程的问题
再考虑是你的抗体问题或者是你的蛋白样本的问题

考虑一下封闭液有没有问题

我又摸了几次条件，延长了转膜时间，结果还不如现在的结果，我换成5%BSA封闭，结果什么也没有，关键是我现在连上面的结果都重复不出来了，我都不知道怎么办了，但是内参每次都能出来，效果还可以，麻烦各位指教指教啊！

换个好点的二抗试试
我也遇到过类似情况，换了二抗之后好了

你的目标蛋白是不是在核内？
如果在核内很可能你提的有效蛋白太少了，条带自然很淡。你的细胞裂解液可能不能充分破裂细胞核。

俺的个人理论是：只要内参出来了，那就是说明操作过程没有问题了

目的条带不出来要考虑的原因是：
1. 样本有没有问题？像楼上所说的原因
2.一抗二抗行不行？ 看你内参的条带，如果是60ug的量的话，内参条带应该已经浓得不像样了，你这内参条带像俺用15～20ug做的内参

建议：换抗体，具体先换哪个，可以从经济效益上考虑吧，俺就不为你做决定了

请问 凝胶成像系统好用吗？我们也快上新机器了，不知道是传统的压片好还是这个好？个人觉得压片的曝光时间很影响结果。

考虑一下蛋白样品中所含目的蛋白是否合适，不能仅靠蛋白定量来确定样品中所含目的蛋白的多少

[img]C:\Users\任泽鹏\Desktop[/img] 哪位大侠帮我看一下 该如何改进呢 做了好长时间了 要么什么也看不到 要么就是这样的多条带？