膜蛋白的提取和纯化

膜蛋白在生物进程中具有关键性的作用。它们参与细胞与细胞之间、细胞与细胞基质之间的相互联系胞器及细胞的形成过程，各种离子、代谢产物和蛋白质的跨质膜运输、RNA 的跨核膜运输等。鉴于膜蛋白在多种细胞功能中的重要性，目前针对各种疾病的药物约有 50% 都以其为靶点。膜蛋白嵌在细胞膜中，水溶性不好，因此，分离和纯化膜蛋白的方法也有所不同。

1. 先分离膜，然后提取；如选用冷热交替法、反复冻融法、超声破碎法、玻璃匀浆法、自溶法和酶处理法使得细胞破碎，然后通过剃度离心得到含有膜蛋白的粗组分。

（例如：michael11 液氮研磨组织→加入匀浆缓冲液及蛋白酶抑制剂→差速离心→蔗糖密度梯度离心→收集 37% 与 41% 间的成分，即为质膜部分→裂解即可收集膜蛋白）。

2. 用特殊的去污剂选择性的分离。

从膜上提取蛋白有许多困难，在多数情况下，都是采用去垢剂将疏水蛋白从其膜结构中溶解下来，然后将蛋白质稳定。去垢剂的选择通常是依据他对所需要蛋白质的提取效率来确定，但在某些情况下，还要考虑到以后的纯化步骤。虽然许多膜蛋白必须在去垢剂存在的情况下进行纯化，但最终仍可能需要除去去垢剂。这常常会引起蛋白质失活，但如果蛋白质是用于测序的，将不是一个问题。如果不是用于测序的，可考虑使用能够黏附去垢剂的疏水珠。

许多文献和生化试剂供应商的产品目录中，都介绍有许多种不同的可用来溶解膜蛋白的去垢剂。然而，他们并不是普遍适用的。在设计膜蛋白溶解方案时，必须考虑某一去垢剂的特殊性质。如 tritonX-100 在 280 nm 处有吸收，如果某蛋白质的测试与 280 nm 处的吸收有关，就应避免使用这类去垢剂。将膜制剂与胞质蛋白及细胞核分离后，再进一步从细胞膜制剂中将所需的膜蛋白增溶下来。这种做法的好处是可以用强烈的去垢剂提取细胞骨架的相关蛋白，而无需考虑胞质蛋白、细胞核成分或染色质成分的混入。使用这种方法所获得的膜蛋白，无论在种类上还是数量上，都比酸溶解法所得到的蛋白（＜ 5000 Da）要多。

一般提取的膜蛋白量往往只占膜蛋白总量的不足 0.1%，所以充分的膜蛋白的提取，无疑对于研究膜蛋白的结构和功能都是非常重要的。第二种方法简单，可靠，但有时含有其他蛋白。一般的都是利用 4 度时所有的蛋白质原则上都溶于 TritonX-114 水溶液，在温度超过 20 度时，此溶液分为水相和去污相；此时亲水性蛋白溶于水相，疏水的膜蛋白溶于去污剂相中。利用此性质可提取膜蛋白。

3. 膜蛋白色谱 （Chromatography of Membrane Protein, CMP），CMP+ 分离强疏水性蛋白、多肽混合物的层析系统，一般有去垢剂（如 SDS）溶解膜蛋白后形成 SDS-融膜蛋白，并由羟基磷灰石为固定相的柱子分离纯化。羟基磷灰石柱具有阴离子磷酸基团（P-端），又具有阳离子钙（C-端），与固定相结合主要决定于膜蛋白的大小、SDS 结合量有关。利用原子散射法研究 cAMP 的分离机制发现，样品与 SDS 结合后在离子交换柱上存在 SDS 分子、带电荷氨基酸与固定相中带电离子间的交换，从而达到分级分离的目的。

4. 顺序抽提法：

根据细胞蛋白溶解性的差异，用具有不同溶解能力的蛋白溶解液进行抽提的方法。用 Tris 碱溶液裂解细胞提取高溶解性蛋白；把未溶解的 pellet 用标准液溶解提取高疏水性蛋白；最后用含复合表面活性剂的蛋白溶解液，最后可以再次抽提前两次抽提后不能溶解的膜蛋白。

5. centrifugal protein extraction 原理：

高渗的蛋白裂解液让细胞溶涨破裂后，超高速离心。

分离纯化膜蛋白

试剂：

PBS、NaCl、Tris（pH 8.0）、MgCl2、EDTA、β-巯基乙醇、TritonX-100

仪器：

超声破碎仪、离心机

1. 细胞破碎后通过梯度离心得到含有膜蛋白的粗组分。

利用超声破碎法的聚体步骤如下：将胰酶消化后的细胞于 1500 r/min 离心 10 分钟，收集细胞沉淀，PBS 洗 3 次。加入细胞裂解液［10 mmol/L NaCl、20 mmol/L Tris（pH 8.0）、2 mmol/L MgCl2、1 mmol/L EDTA、1 mmol/L β-巯基乙醇、0.2% TritonX-100］，冰浴 20 分钟，超声波处理 5 分钟，然后于 2500 r/min 离心 10 分钟，取上清。32000 g 离心 30 分钟，将沉淀用 1 mL PBS 重悬，-40℃ 保存。

2. 用特殊的去垢剂进行选择性的分离原则上，所有蛋白质在 4 ℃ 时都溶于 TritonX-114 水溶液。但在 37℃ 时，此溶液分为水相和去垢剂相：亲水性蛋白溶于水相，疏水的膜蛋白溶于去垢剂相中。

具体步骤是：将 TritonX-114 水溶液于 4 ℃ 下离心 5 分钟（10000 g）；37 ℃ 水浴 10 分钟以分离水相和去垢剂相，然后于 37 ℃ 下离心 5 分钟（2000 g）；用 500 mL 冰冷的缓冲液［10 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5），150 mmol/L NaCl，5 mmol/L EDTA（PH 7.5）］ 溶解去垢剂相沉淀，冰浴 2 分钟后加温至 37 ℃，再次离心 5 分钟（2000 g）；加入 500 ml 冰冷的缓冲液再次抽提去垢剂相。

去垢剂的选择通常是依据对蛋白质的提取效率以及后续的纯化步骤来确定。得到纯化的膜蛋白后，最终需要去除去垢剂。但这常常会引起蛋白质失活。如果蛋白质是用于测序的，这不是问题。如果不是用于测序的，可考虑使用能够黏附去垢剂的疏水柱。许多文献中都介绍了多种可用来溶解膜蛋白的去垢剂，但它们并不是普遍适用的。在设计膜蛋白溶解方案时，必须考虑某一去垢剂的特殊性质，例如 TritonX-100 在 280 nm 处有吸收，如果某蛋白质的测试与 280 nm 处的吸收有关，就应避免使用这类去垢剂。