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包含体蛋白质的提取和纯化

相关实验:特殊蛋白质的分离纯化

最新修订时间:

简介

在利用大肠埃希菌表达重组蛋白时,经常会得到包含体。包含体分离纯化难度大,只有在变性后才能形成可溶性的形式予以纯化。纯化后的变性蛋白质需要重新复性(renaturation),才能折叠成正确的天然构象和恢复原有的生物活性。

原理

包含体是细胞感染病毒后胞浆或核中出现的特殊结构。 常用于病毒病的诊断。 根据病毒种类,包含体表现大小不一,形态各异,单一或多个,嗜酸或嗜碱。 它代表着病毒粒子的合成场所,故又称病毒工厂(virus factory)或病毒原质体(viroplasma)。包含体分离纯化难度大,只有在变性后才能形成可溶性的形式予以纯化。纯化后的变性蛋白质需要重新复性(renaturation),才能折叠成正确的天然构象和恢复原有的生物活性。

材料与仪器

试剂:

溶菌酶、EDTA、Tris、去垢剂 Triton X-100、尿素

仪器:

超声破碎仪、离心机、凝胶层析柱、透析袋

步骤

(一)裂菌、洗涤及溶解

1.裂菌利用溶菌酶破碎细菌的细胞膜,再结合超声破碎方法裂解细菌。细菌裂解后,5000~20000 g 离心 15 分钟,可以使大多数包含体沉淀,与可溶性蛋白分离开。

2.洗涤为了弃除包含体上黏附的杂质,通常用低浓度的变性剂,如含 2mol/L 尿素的 1 mmol/LEDTA(50 mmol/L Tris,pH7.0~8.5)洗涤。过高浓度的尿素或盐酸胍会使包含体溶解。温和的去垢剂 Triton X-100 和脱氧胆酸也可以弃除膜碎片和膜蛋白。

3.溶解利用 6~8 mol/L 尿素或 5~8 mol/L 盐酸胍将包含体溶解。盐酸胍是强于尿素的变性剂。

(二)变性蛋白质的复性

1.复性过程蛋白质在尿素浓度为 4 mol/L 时开始复性,到 2 mol/L 时复性结束。对于盐酸胍而言,从浓度为 4 mol/L 开始复性,到 1.5 mol/L 时复性结束。常用的包含体蛋白质复性方法有疏水层析柱复性和凝胶层析柱复性两类。凝胶层析柱复性均用 Sephacryl S-100 或 Superdex 75 等层析介质,层析柱的长度为 40~100 cm。层析柱复性回收率高(高达 90% 以上)、速度快、易于放大、样品稀释倍数小(一般 5 倍左右)。

2.复性效率蛋白质复性取决于蛋白质本身的特性以及所处的环境。有些蛋白非常容易复性,如牛胰 RNA 酶的复性效率可以达到 95% 以上,但有一些蛋白至今还没有发现能够使其复性到天然构象的理想方法。纯化白细胞介素-2 时,以 SDS 溶液中加入铜离子(0.05% SDS,7.5~30 μmol/L CuCl2)的方法,25~37 ℃ 下反应 3 小时,再用 1 mmol/L EDTA 终止反应,复性后的二聚体低于 1%。一般说来,蛋白质的复性效率应在 20% 左右。

3.影响复性效率的因素复性缓冲液的最适 pH 是 8.0~9.0,最适温度为 4 ℃,复性时间一般为 24~36 小时。复性时的蛋白质浓度应该控制在 0.1~0.5 mg/ml,过高的浓度会影响到复性。在磁力搅拌下,逐滴将变性的蛋白质加入复性液中,使变性的蛋白质在复性缓冲液中始终处于低浓度状态。如果过快地将变性蛋白质加入到复性缓冲液中,容易形成絮状沉淀,这是蛋白质重新凝聚的前兆。

复性完毕后,蛋白质要装入透析袋,在低浓度的缓冲液中连续缓慢透析 12~24 小时;透析不能太快;透析前后均要离心。

4.提高包含体蛋白复性产率的方法在包含体蛋白质复性过程中,加人促进剂可以增加折叠复性中间体的溶解性,导致形成稳定的、具有正确天然结构的蛋白质。

(1)添加氧化交换系统:对于含有二硫键的蛋白,复性过程通过氧化交换系统可以促使不正确的二硫键配对发生快速交换反应,从而提高了正确配对的二硫键的产率。常用的氧化交换系统有谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽(GSH/GSSG)、DTT/GSSG 等,其中 GSH/GSSG 最为常用。通常使用 1~3 mmol/L 还原型巯基试剂,还原型和氧化型巯基试剂的比例通常为 10:1~5:1。

(2)添加小分子化合物:小分子化合物通过破坏错误折叠中间体的稳定性,或增加折叠中间体和未折叠分子的可溶性来提高复性产率,如盐酸胍、脲、烷基脲以及碳酸酰胺类等,在非变性浓度下是很有效的促进剂。蛋白质的辅助因子 Zn或 Cu可以稳定蛋白质的折叠中间体,防止蛋白质的聚集。浓度大于 0.4 mol/L 的 Tris 缓冲液可提高包含体蛋白质的折叠效率,浓度为 0.4~0.6 mol/L 的 L-Arg 有助于增加复性中间产物的溶解度。硫代甜菜碱类物质(non-detergent sulfobetaines,NDSBs)是近年来出现的可促进蛋白复性的新家族,NDSBs 由一个亲水的硫代甜菜碱及一个短的疏水基团组成,不属于去垢剂,易于透析去除。目前常用的有 NDSB-195,NDSB-201 和 NDSB-256。

(3)添加分子伴侣和折叠酶:研究得比较透彻的分子伴侣有 Hsp60/GroE 和 Hsp70/DnaK。折叠酶包括硫氧还蛋白二硫键异构酶、肽酰辅氨酰顺反异构酶等。但这类蛋白在折叠复性后要除去,而且十分昂贵,因此采用可回收利用的方法如固定化法为好。

来源:丁香实验

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