蛋白质纯化

1. 按正确读框将DNA片段亚克隆入合适的pGEX载体中，转化大肠杆菌感受态细胞， 在LB/氨苄青霉素平皿上筛选转化子，以不插入外源DNA的自连载体作对照，平皿置37℃孵育12~15 h。 2. 挑取转化菌落接种于2 ml LB/氨苄青霉素培养基，并在氨苄青霉素主平板上划线培养。同时接种含母本pGEX载体的转化菌作对照。将主平板于37℃下温育12~15 h。液体培养物则于37℃摇床中振荡

根据离子交换原理，将经硫酸铵粗提的含McAbγ球蛋白上样结合于层析柱上，通过增加洗脱液中的离子强度，洗脱并收集蛋白峰。

操作流程如下：1) 用 SDS-PAGE 分离待研究蛋白。2) 凝胶用 0.05% 考马斯亮蓝 G 染色 15~30 min。3) 用含 5% 乙酸的 10% 甲醇溶液脱色。4) 在水中浸泡 10 min。5) 从凝胶上切下蛋白带，转移至微量离心管。切下一段不含蛋白质的凝胶作对照。如必要，可将凝胶切成较小的碎片，使之能容易地沉入微量离心管的底 部。6) 各管加入 1 ml 50% 甲醇。室温下孵育

用于亲和层析的凝集素应根据它们结合的特异性和紧密度加以选择。例如，刀豆素 A（Con A）与糖蛋白含有的葡萄糖或甘露糖结合，而麦芽凝集素只与具 N-乙酰葡糖胺的蛋白质结合。胞膜糖蛋白常与麦芽凝集素结合，而可溶性糖蛋白却通常用 Con A 或扁豆凝集素亲和柱纯化。由于在许多情况下被纯化的糖蛋白的结构和特性不清楚，所以筛选一些凝集素与目的蛋白的结合状况常常是有用和必要的。用于此目的的凝集素试剂盒也可购

作为噬菌体衍生的酶，内溶素本质是一种蛋白分子，其通过分解细菌细胞壁的肽聚糖成分，帮助噬菌体颗粒从细菌宿主释放，可在噬菌体复制过程中表达，破坏细菌细胞壁肽聚糖的关键化学键。

Q Sepharose Fast Flow 离子交换层析法纯化 IgG1 是利用在中性 pH 环境中 Q SepharoseFast Flow 更倾向于结合小鼠腹水中的非目的蛋白，故在用盐溶液梯度洗脱时，McAb 会较早被洗脱或出现在穿过液中，从而可得到分离纯化的 IgG1。

免疫印迹法（Western Blot，WB）是一种通过识别蛋白质的特定抗原性进行检测和分析的方法，可用于抗体纯化。在免疫印迹法中，通过利用蛋白质的亲和性和特异性，将抗血清中的待纯化抗体与其所特异结合的抗原分离出来。

在利用大肠埃希菌表达重组蛋白时，经常会得到包含体。包含体分离纯化难度大，只有在变性后才能形成可溶性的形式予以纯化。纯化后的变性蛋白质需要重新复性（renaturation），才能折叠成正确的天然构象和恢复原有的生物活性。

目前约 70％ ~ 80％ 的抗体纯化使用 Protein A/G 亲和层析法。Protein A 与 IgG 的结合强度很大程度上依赖于该抗体的种属和亚类，而 Protein G 对于大多数哺乳动物的 IgG 则有着更高的亲和力，因此，Protein G 可用于纯化不能与 Protein A 很好结合的哺乳动物单抗或多抗 IgG 的纯化。

串联亲和纯化技术法是由 Rigaut 等于 1999 年建立的能快速研究体内蛋白质相互作用的新技术，用于在接近细胞真实生理状态的条件下纯化细胞体内的蛋白质复合体。

琼脂糖颗粒和诱饵蛋白复合体在洗涤时并不会损失而且所有反应都含有等量的诱饵蛋白。为了证明在洗涤期间没有任何材料损失，应使用 1/10 的 GST 融合体加样做平行 SDS-PAGE 凝胶电泳并染色以便更确切地比较 GST 融合体蛋白带。另外，融合蛋白的降解可能导致诱饵蛋白的量减少，尤其是当使用粗提物（见图 19.2.1）而不是纯化标记的实验蛋白时。在对结合实验蛋白进行定量时必须将降解量计算在内。

蛋白质在水溶液中的溶解度是由蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜的程度，以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。当用中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。

在疏水层析的主要支持介质上含有大小不等的疏水侧链，烷基或芳香基，可是绝大多数情况起作用的是苯基或辛基。当碳氢链长度增加，即变得更疏水时，疏水强的少量蛋白质被吸附。这时疏水相互作用太强，需用极端方法洗脱，可能会导致蛋白质变性。苯基琼脂糖比辛基琼脂糖疏水性低，是疏水纯化中效果不错的常用介质，尤其是试用于纯化开始时。疏水相互作用介质苯基琼脂糖-O-CH2-CHOH-CH2-O-C6H5辛基琼脂糖-O-C

离子交换层析（IEC）用于蛋白质分离的原理的是基于带相反电荷分子间的相互吸引力，其中蛋白质表面所带的电荷取决于蛋白质 pI 和环境 pH。蛋白质的保留时间和盐浓度决定了其与基质表面相互作用的结合位点数量。一般在低盐浓度时使蛋白质结合，而在高盐浓度时洗脱蛋白质。等度洗脱的洗脱窗口很低，因此通常以线性盐浓度梯度洗脱蛋白质。

分子筛色谱又称凝胶排阻色谱、凝胶过滤和排阻层析，是 20 展来的一种新型的液相层析分离纯化方法。它的分离基础主要根据物质分子大小不同而进行。分子筛色谱所用的基质我们通常称之为好胶，它是具有立体网状结构且呈珠状的颗粒物质，每个颗粒犹如一个筛子，当将混合物样品加入层析柱进行洗脱时，大分子物质不多孔凝胶基质能进入基质内部而沿颗粒间的空隙随着溶剂流动，由于其流程较短，移动速度快而最先流出柱外;小分子物质则

蛋白质表面一般有疏水与亲水基团，疏水层析是利用蛋白质表面某一部分具有疏水性，与带有疏水性的载体在高盐浓度时结合。在洗脱时，将盐浓度逐渐降低，因其疏水性不同而逐个地先后被洗脱而纯化，可用于分离其它方法不易纯化的蛋白质。疏水性蛋白质溶解于水溶液中时会发生自我聚集或自身相互作用。这种自我聚集是形成多种生物学相互作用的基础，如蛋白质的折叠、蛋白质-底物间的相互作用及蛋白质，通过细胞膜的跨膜运输。疏水作用层

通过生物分子之间的特异性相互作用来分离物质的一种层析方法。包括基于空间结构特异结合的抗原/抗体，酶/底物、底物类似物、抑制剂、激活剂、辅因子，激素/受体，核酸/核酸结合蛋白、互补核酸序列，和基于电子的供体和受体相互作用的金属螯合、嗜硫亲和等。该分离纯化蛋白的方法高效、简单、快速、选择性高。