原理
根据离子交换原理,将经硫酸铵粗提的含McAbγ球蛋白上样结合于层析柱上,通过增加洗脱液中的离子强度,洗脱并收集蛋白峰。
材料与仪器
PBS
缓冲液
层析柱 高效液相色谱仪
缓冲液
层析柱 高效液相色谱仪
步骤
1. 腹水10000 g离心10 min,除去细胞和杂质,在4 ℃条件下逐滴加入饱和硫酸铵溶液,使终浓度为40 %饱和硫酸铵搅拌20~30 min
2. 离心,沉淀用40 %饱和硫酸铵洗涤2次后溶于PBS,对缓冲液A(PH8.5 20 mM Tris缓冲液)透析除盐4 ℃过夜
3. 用带有1000 μl样品环的高压加样活门将透析后粗提物加样于经缓冲液A液平衡的TSK DEAE SPW离子交换层析柱
2. 离心,沉淀用40 %饱和硫酸铵洗涤2次后溶于PBS,对缓冲液A(PH8.5 20 mM Tris缓冲液)透析除盐4 ℃过夜
3. 用带有1000 μl样品环的高压加样活门将透析后粗提物加样于经缓冲液A液平衡的TSK DEAE SPW离子交换层析柱
4. 洗脱流速1 ml/min
0~1 min:0→5%缓冲液B(20 mM Tris,PH8.5,含2.0 M醋酸钠)
1~20 min(线性梯度洗脱):5→20%缓冲液B
20~22 min:20→0%缓冲液B
5. 洗脱液用紫外280 nm进行监测
6. 收集蛋白峰,进行含量、纯度和活性测定
注意事项
1. 所用缓冲液和加样粗提物均需0.22 μm滤膜过滤。
2. 在本实验条件下,IgG1峰一般在线性梯度洗脱开始11~12 min。但不同类和亚类抗体以及不同特异性McAb的存留时间(retention time)有所差异。
2. 在本实验条件下,IgG1峰一般在线性梯度洗脱开始11~12 min。但不同类和亚类抗体以及不同特异性McAb的存留时间(retention time)有所差异。
来源:丁香实验