高效液相色谱纯化小鼠腹水中单克隆抗体

从小鼠腹水中纯化mcab的方法有盐析、离子交换层析、凝胶过滤和亲合层析等。应用tsk deae-spw离子交换层析柱从小鼠腹水中纯化mcab不仅纯化速度快，回收率和得率高，而且保持良好的生物学活性。

一、原理

根据离子交换原理，将经硫酸铵粗提的含mcabγ球蛋白上样结合于层析柱上，通过增加洗脱液中的离子强度，洗脱并收集蛋白峰。

二、试剂和器材

1、tsk deae spw离子交换层析柱（75mm×7.5mm，bio rad）

2、高效液相色谱仪（包括控制系统、溶剂传递系统、高压加压活门和紫外280nm监测系统）

3、PBS，缓冲液a和b。

三、操作步骤

腹水离心10000 g，10min，除去细胞和杂质，在4℃下逐滴加入饱和硫酸铵溶液，使终浓度为40%饱和硫酸铵

↓搅拌20～30min

离心，沉淀用40%饱和硫酸铵洗涤2次后溶于PBS，对缓冲液a（pH8.5， 20mmol/l tris缓冲液）透析除盐

↓4℃过夜

用带有1000μl样品环的高压加样活门将透析后粗提物加样于经缓冲液a液平衡的tsk deae spw离子交换层析柱

↓

洗脱流速1ml/min

0～1min ：0→5%缓冲液b（20nmol/l tris， pH 8.5，含2.0 mol/l醋酸钠）

1～2 min（ 线性梯度洗脱）：5→20%缓冲液b

20～22min：20→0%缓冲液b

↓

洗脱液用紫外280nm进行监测

↓

收集蛋白峰，进行含量、纯度和活性测定

四、注意事项

1、所用缓冲液和加样粗提物均需0.2μm滤膜过滤。

2、在本实验条件下，IgG1峰一般在线性梯度洗脱开始11-12min。但不同类和亚类抗体以及不同特异性mcab 的存留时间（retention time）有所差异。