采用高效液相色谱法纯化小鼠腹水中单克隆抗体实验步骤
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从小鼠腹水中纯化McAb的方法有盐析、离子交换层析 、凝胶过滤和亲和层析等。应用TSK DEAE-SPW离子交换层析柱从小鼠腹水中纯化McAb不仅纯化速度快,回收率和得率高,而且保持良好的生物学活性。
(一) 原理
根据离子交换原理,将经硫酸铵粗提的含McAbγ球蛋白上样结合于层析柱 上,通过增加洗脱液中的离子强度,洗脱并收集蛋白峰。
(二)操作步骤
腹水10,000g离心10min,除去细胞和杂质,在4℃条件下逐滴加入饱和硫酸铵溶液,
使终浓度为40%饱和硫酸铵
↓搅拌20~30min
离心,沉淀用40%饱和硫酸铵洗涤2次后溶于PBS ,对缓冲液A(PH8.5 20mM Tris缓
冲液)透析除盐
4℃过夜
用带有1000μl样品环的高压加样活门将透析后粗提物加样于经缓冲液A液平衡的
TSK DEAE SPW离子交换层析 柱
洗脱流速1ml/min
0~1min:0→5%缓冲液B(20mM Tris, PH8.5, 含2.0M醋酸钠)
1~20min(线性梯度洗脱):5→20%缓冲液B
20~22min:20→0%缓冲液B
洗脱液用紫外280nm进行监测
收集蛋白峰,进行含量、纯度和活性测定
(三) 试剂和器材
1. TSK DEAE SPW离子交换层析 柱(75×7.5mm, Bio Rad)
2. 高效液相色谱仪(包括控制系统、溶剂传递系统、高压加压活门和紫外280nm监测系统)。
3. PBS,缓冲液A和B
(四) 注意事项
1. 所用缓冲液和加样粗提物均需0.22μm滤膜过滤。
2. 在本实验条件下,IgG1峰一般在线性梯度洗脱开始11~12min。但不同类和亚类抗体以及不同特异性McAb的存留时间(retention time)有所差异。