采用高效液相色谱法纯化小鼠腹水中单克隆抗体实验步骤

从小鼠腹水中纯化McAb的方法有盐析、离子交换层析、凝胶过滤和亲和层析等。应用TSK DEAE-SPW离子交换层析柱从小鼠腹水中纯化McAb不仅纯化速度快，回收率和得率高，而且保持良好的生物学活性。

(一)　原理

根据离子交换原理，将经硫酸铵粗提的含McAb γ 球蛋白上样结合于层析柱上，通过增加洗脱液中的离子强度，洗脱并收集蛋白峰。

(二)操作步骤

腹水10,000 g离心10min，除去细胞和杂质，在4 ℃条件下逐滴加入饱和硫酸铵溶液，

使终浓度为40%饱和硫酸铵

搅拌20～30min

离心，沉淀用40%饱和硫酸铵洗涤2次后溶于PBS，对缓冲液A(PH8.5 20 mM Tris缓冲液)透析除盐

4 ℃过夜

用带有1000 μl样品环的高压加样活门将透析后粗提物加样于经缓冲液A液平衡的

TSK DEAE SPW离子交换层析柱

洗脱流速1 ml/min

0～1min：5%缓冲液B(20 mM Tris, PH8.5, 含2.0 M醋酸钠)

1～20min(线性梯度洗脱)：20%缓冲液B

20～22min：20%缓冲液B

洗脱液用紫外280 nm进行监测

收集蛋白峰，进行含量、纯度和活性测定

(三)　试剂和器材

1.    TSK DEAE SPW离子交换层析柱(75×7.5 mm, Bio Rad)

2.　高效液相色谱仪(包括控制系统、溶剂传递系统、高压加压活门和紫外280 nm监测系统)。

3.　PBS，缓冲液A和B

(四)　注意事项

1.　所用缓冲液和加样粗提物均需0.22 μm滤膜过滤。

2.　在本实验条件下，IgG1峰一般在线性梯度洗脱开始11～12min。但不同类和亚类抗体以及不同特异性McAb的存留时间(retention time)有所差异。