大叶紫株中乌索酸的提取纯化与反相高效液相色谱分析

　　【摘要】 　　目的提取纯化大叶紫株叶中的乌索酸，并建立其含量测定方法。方法采用“醇提凝析法”提取纯化乌索酸，IR、MS、NMR鉴定其结构。建立反相高效液相色谱（RP-HPLC）测定其含量的方法，色谱柱为Symmetry Shield RP18柱，流动相为甲醇-水（体积比88∶12），流速1.0 ml/min，检测波长210 nm，柱温25℃。结果乌索酸在4.5～22.5μg范围内线性关系良好（r=0.999 8），RP-HPLC测定样品乌索酸含量为98.30%，得率为0.376%。结论“醇提凝析法”提取乌索酸工艺实用可行，为工业试验生产乌索酸提供了技术条件；RP-HPLC法测定乌索酸含量准确、精密度高、重复性好、线性范围宽，可作为控制乌索酸质量的方法。

　　【关键词】  大叶紫株叶 乌索酸 结构表征 反相高效液相色谱

　　Abstract：ObjectiveTo extract and purify ursolic acid from Callicarpa macrophylla Vahl leaves and to establish a determination method for ursolic acid. MethodsUrsolic acid was extracted from Callicarpa macrophylla Vahl leaves by method of ethanol extracting and agglutination separating, and its structure was identified by IR, MS and NMR. A determination method of ursolic acid in Callicarpa macrophylla Vahl leaves by reversed- phase high performance liquid chromtograph was established. The chromatographic column (Symmetry Shield RP18), methanol-water mobile phase(88:12, V/V) with 1.0 ml/min flow rate, the detection wavelength (210nm) and the column temperature (25℃) were adopted. ResultsUrsolic acid showed good linear relationship in the range of 4.5～22.5μg(r=0.999 8). The content was 98.30% and the gained rate was 0.376 %. ConclusionThe method of ethanol extracting and agglutination separating to extract ursolic acid is advanced, rational, practical and feasible, and it provided technology condition for industrial production for ursolic acid. RP-HPLC is simple,accurate, repeatable and with wide linear range. It can be used to evaluate the quality of ursolic acid.

　　Key words：Callicarpa macrophylla Vahl leaf;   Ursolic acid;   Structural characteristics;   RP-HPLC

　　大叶紫株Callicarpa macrophylla Vahl.为马鞭草科紫株属植物，以根、茎、叶入药。大叶紫株为灌木，生于海拔110～2 000 m的山坡路旁、疏林下或灌丛中。我国主要分布于广东、广西、贵州、云南、湖南、江西等省。其味苦、微辛，性平，具有散瘀止血、消肿止痛的功效,主治咯血、吐血、便血、创伤出血、跌打瘀肿、风湿痹痛等症，为民间止血要药［1］。胡氏报道马鞭草科紫株属植物紫株Callicarpa pedunculata R.Brown中乌索酸的含量高达1%，可作为乌索酸的资源植物［2］。为此，我们首次以大叶紫株Callicarpa macrophylla Vahl.的叶为原料，采用“醇提凝析法”提取分离乌索酸［3，4］，并建立RP-HPLC测定分析乌索酸含量的方法，为开发利用大叶紫株药用植物资源提供科学依据。

　　1  器材

　　1.1  材料

　　大叶紫株叶采自江西省奉新县甘坊乡，经江西省天然药物活性成分研究重点实验室鉴定为大叶紫株Callicarpa macrophylla Vahl.的叶子。95 %乙醇（食用级，南昌利康药械实业有限公司生产）；“YCXY- 1 号”除杂剂（自制）；复合酶制剂（哈尔滨神农有限公司生产）；活性炭（分析纯，上海豪申化学试剂有限公司生产）；甲醇（色谱纯，天津市大茂化学试剂厂生产）；水为超纯水；乌索酸对照品（中国药品生物制品检定所提供，批号110742 - 200314）。

　　1.2  仪器

　　Waters系列高效液相色谱仪（515双泵，2996光电二极管阵列检测器，Empower中文色谱数据工作站，美国）；Perkin-Elmer傅立叶变换红外光谱仪(美国)； Autospec - Ultima ETOF EL 型质谱仪(美国)；INOVA - 600 型、Brucker ACF - 400 型核磁共振仪(美国)；Boetius显微熔点测定仪(北京)；WZZ-1S数字式自动旋光仪(上海)；RO-MB-10D高纯水机(杭州永洁达膜分离设备厂)，CP225D电子分析天平(德国Sartourius公司)，FW100型高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)，202-26A型数显电热恒温干燥箱(上海阳光实验仪器有限公司)。

　　2  方法

　　2.1  乌索酸的提取分离

　　2.1.1  工艺流程见图1。

　　2.1.2  操作步骤采用“醇提凝析法”提取分离。将干燥后的大叶紫株叶10 kg 粉碎成粗粉（20目），用温水湿润，加入原料干重1%的复合酶制剂，38℃酶解处理24 h，滤干，加入7倍重量90%乙醇，85℃回流提取2次，1 h/次，合并提取液，过滤，减压回收乙醇得浸膏，以纯水沉降洗涤后加“YCXY- 1 号”除杂剂除杂处理2次，过滤，用95 %乙醇溶解，调pH值碱化，加活性炭脱色，过滤除杂，再用95%乙醇溶解，调pH值酸化，凝析分离、纯化精制，80℃干燥24 h，得无色针状结晶37.6 g，得率为0.376%。

　　3   结果

　　3.1  样品结构鉴定样品为无色针状结晶，易溶于热乙醇、热甲醇，可溶于乙醚、醋酸乙酯、乙醇、甲醇、丙酮、氯仿等有机溶剂，不溶于石油醚和水，醋酐-浓硫酸反应显紫红色，香英兰素-硫酸反应呈紫色。［α］D20 + 65°(C0.095 , EtOH)，熔点285～287℃，与乌索酸对照品混合熔点不下降。

　　以上光谱数据与文献值一致［5,6］，根据光谱数据确证样品为乌索酸。

　　3.2  乌索酸样品含量测定

　　3.2.1  对照品溶液配制

　　精密称定乌索酸对照品9.8 mg，置于10 ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，制成对照品溶液。

　　3.2.2  样品溶液配制

　　精密称定乌索酸样品9.6 mg，置于10 ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为样品溶液。

　　3.2.3  检测波长的选择

　　取乌索酸对照品和样品溶液进样，在190～500 nm波长范围进行光谱扫描，乌索酸在流动相中的最大紫外吸收波长均为204.5 nm (图2)，但由于流动相在短波长处有末端吸收，为了消除背景，提高信噪比，提取不同波长的色谱图进行比较，选择210 nm为检测波长，信噪比高，峰形好，干扰小，最大限度地保证分析结果的准确。

　　3.2.4  色谱条件

　　色谱柱为Symmetry Shield RP18柱（3.9 mm×150 mm，5 μm）；流动相为甲醇-水（体积比88∶12），流速1.0 ml/min；检测波长210 nm；柱温为25℃。以乌索酸计，理论塔板数为17 895，外标法定量分析。

　　3.2.5  线性关系实验

　　用微量注射器精密吸取乌索酸对照品溶液1，2，6，10，14，18 μl进样分析，平行3次，按色谱条件测定峰面积，以对照品的进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得乌索酸回归方程为：Y=1.42×105X +2.19×104（r=0.999 8）。表明当乌索酸进样量在4.5～22.5 μg之间时，线性关系良好。

　　3.2.6  精密度实验

　　精密吸取乌索酸对照品溶液10μl进样，重复5次，测得乌索酸峰面积RSD为0.80%(n = 5)，本方法精密度良好。

　　3.2.7  重复性实验

　　精密称取同一批乌索酸样品5份，配制样品溶液，吸取10μl 进样分析，测得乌索酸峰面积RSD为1.12 %(n = 5) ，方法重复性好。

　　3.2.8  乌索酸含量测定

　　吸取样品溶液10 μl进样分析，重复进样5次，样品中乌索酸的含量为98.30%。

　　4  结论

　　采用“醇提凝析法”从大叶紫株叶中提取纯化乌索酸，仅以乙醇为溶剂，未加其它有机溶剂，采用自制的“YCXY- 1 号”除杂剂，有效去除脂类、类脂类、酚类及叶绿素等杂质，不仅提高了产品的安全性，而且简化了操作程序，降低了生产成本，有利于乌索酸的富集和纯化，其含量达98.30%，得率达0.376%，具有制备量大，质量稳定，易于实现工业化生产等特点。

　　本文建立的RP-HPLC定量分析乌索酸含量的方法，具有简便快速、精密度高、重复性好、线性范围宽的优点，可作为控制乌索酸产品质量的方法。

　　致谢：乌索酸的质谱、核磁共振谱由中国海洋大学药物研究所李英霞教授代测，谨表谢意！

　　【参考文献】

　　［1］国家中医药管理局《中华本草》编委会. 中华本草精选本，第6册［M］.上海：上海科技出版社,1996：5928.

　　［2］胡益明,沈月毛,顾琼仙,等. 中药紫株的化学成分研究［J］.中草药,2001,32(12)：1063.

　　［3］李开泉,陈 武,熊筱娟,等.乌索酸的化学研究概况［J］.宜春医专学报,2001,13(2)：128

　　［4］陈武,李开泉,熊筱娟,等.陆英抗肝炎活性成分的研究［J］.宜春医专学报,2000,12(4):239.

　　［5］丛浦珠. 质谱学在天然有机化学中的应用［M］.北京：科学出版社, 1987：684.

　　［6］彭师奇. 药物的波谱解析［M］.北京:北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社,1998：10