毛泡桐叶中乌索酸的提取分离及反相高效液相色谱分析

　　【摘要】 　　目的提取鉴定毛泡桐叶中的乌索酸，并建立其含量测定方法。方法采用“醇提凝析法”新工艺分离制备乌索酸，IR，MS，NMR 鉴定其结构。建立反相高效液相色谱测定其含量的方法，色谱柱为 KromasilC18 柱，流动相为乙腈-甲醇-水-磷酸（体积比168∶682∶150∶1.68），流速0.8 ml/min，检测波长210 nm，柱温25℃。结果乌索酸在0.92～16.56 μg范围内线性关系良好（r=0.999 6）。样品乌索酸含量为99.61%，得率为30.5%。结论 “醇提凝析法”分离制备乌索酸工艺先进，实用可行，为工业试验生产乌索酸提供了技术条件；RP-HPLC法测定乌索酸含量准确、精密度高、重复性好、线性范围宽，可作为控制乌索酸质量的方法。

　　【关键词】  毛泡桐叶 乌索酸 结构表征 反相高效液相色谱

　　Abstract：Objective：To extract and identify ursolic acid from Paulownia tomentosa (Thunb. ) Steud leaves and to establish a determination method of ursolic acid. Methods：Ursolic acid was extracted from Paulownia tomentosa(Thunb. ) Steud leaves by adopting a new method of ethanol extraction and agglutination separation, and its structure was identified by IR, MS and NMR. A determination method of ursolic acid in Paulownia tomentosa (Thunb.) Steud leaves by reversed- phase high performance liquid chromtograph was established. The chromatographic column (KromasilC18, 4.6 mm×250 mm, 5 μm), acetonitrile-methanol-water-phosphoric acid mobile phase(168:682:150:1.68, V/V) with 0.8 ml/min flow rate, the detected wavelength(210 nm) and the column temperature (25℃) were adopted. Results：Ursolic acid showed good linear relationship in the range of 0.92～16.56 μg(r=0.999 6). The average recovery rate was 99.82% (RSD was 0.75%). The content was 99.61% and the gain rate was 3.05 ‰. Conclusion：The method of ethanol extraction and agglutination separation to extract ursolic acid is advanced, rational, practical and feasible, and it provides technology condition for industrial production of ursolic acid. RP-HPLC is simple and accurate, it has good repeatability and wider linear range, and it can be used to evaluate the quality of ursolic acid.

　　Key words：Paulownia tomentosa (Thunb.) Steud leaf;   Ursolic acid;   Structural characteristics;   RP-HPLC

　　毛泡桐叶为玄参科泡桐属植物毛泡桐Paulownia tomentosa (Thunb.) Steud 的叶子［1］。泡桐的药用价值我国古代就有记载，《本草纲目》（1578年）记有“桐叶主恶蚀疮著阴皮主五痔、杀三虫，花主傅猪疮，消肿、生发。”泡桐的花、叶、果、木、皮、根均可入药［2］。泡桐叶含桃叶珊瑚苷、泡桐苷、毛蕊花苷、异毛蕊花苷、糖苷、多酚类［2］及熊果酸、乙酰熊果酸α,β［3］等，其中三萜酸类，特别是乌索酸和齐墩果酸，具有抗菌、抗肝炎、抗肿瘤、降血糖血脂、增强免疫功能等多种药理作用，已引起人们广泛的关注［5，6］。为此，我们以毛泡桐叶为原料，采用“醇提凝析法”提取分离乌索酸［5，6］，并建立 RP-HPLC 测定分析乌索酸含量的方法，为开发利用丰富的毛泡桐药用植物资源提供科学依据。

　　1  器材与方法

　　1.1   材料

　　毛泡桐叶采自江西宜春市宜春学院北校区，经江西省天然药物活性成分研究重点实验室鉴定为紫花毛泡桐P.tomentosa(Thunb) Steud的叶子。95 %乙醇（食用级，南昌利康药械实业有限公司）；“YCXY- 1 号”除杂剂（自制）；复合酶制剂（哈尔滨神农有限公司）；活性炭（分析纯，上海豪申化学试剂有限公司）；甲醇（色谱纯，天津市大茂化学试剂厂）；水为超纯水；乌索酸对照品（中国药品生物制品检定所提供，批号110742 - 200314）。

　　1.2 仪器Waters 系列高效液相色谱仪（515双泵，2996光电二极管阵列检测器，Empower 中文色谱数据工作站，美国）；Perkin-Elmer傅立叶变换红外光谱仪(美国)； Autospec - Ultima ETOF EL 型质谱仪(美国)；INOVA - 600 型、Brucker ACF - 400 型核磁共振仪(美国)；Boetius显微熔点测定仪(北京)；WZZ-1S 数字式自动旋光仪(上海)；RO-MB-10D 高纯水机(杭州永洁达膜分离设备厂)，CP225D 电子分析天平(德国Sartourius公司)，FW100 型高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)，202-26A 型数显电热恒温干燥箱(上海阳光实验仪器有限公司)。

　　1.3  乌索酸的提取分离

　　1.3.1  工艺流程见图1。

　　1.3.2   操作步骤采用“醇提凝析法”提取分离。将干燥后的毛泡桐叶 10 kg 粉碎成粗粉（20目），用温水湿润，加入原料干重1%的复合酶制剂，38℃ 酶解处理24 h，滤干，加入8倍重量90%乙醇，85℃回流提取2次，1h/次，合并提取液，过滤，减压回收乙醇得浸膏，以纯水沉降洗涤后加“YCXY- 1 号”除杂剂除杂处理2次，过滤，用 95 % 乙醇溶解，调pH值碱化，加活性炭脱色，过滤除杂，再用 95% 乙醇溶解，调pH值酸化，凝析分离、纯化精制，80℃ 干燥24 h ，得无色针状结晶 30.5g，得率为3.05‰。

　　2   结果

　　2.1  样品结构鉴定样品IRKBr maxυ cm-1：3 434(-OH)、2 968、2 927、2 871（C-H）、1 694（C=O）、1 456、1 384（CH3）、1 031（C-O）；EI-MS(m/z)：456(M+)、441（M-CH3）、438（M-H20）、423（M-CH3-H20）、411（M -COOH）、410（M-H-COOH）；D、E环离子a（C环经RDA裂解）：248(a-100)、203(a-COOH)、189(a-CH2- COOH)、133；A、B环离子b（C环经RDA裂解）：208(b)、207(b-H)、190(b-H2O)和189（b-H2O-H）；1H-NMR(DMSO-d6) 示5个季碳甲基：（δ0.68、0.75、0.87、0.89、1.04，各3H，s）；2个叔碳甲基(δ0.81，J=6.2Hz; 0.91，J=6.0Hz，各3H，d)；C18(δ2.01，J=11.4Hz，d)；C3α-H(δ3.00，J=11.0，5.2，5.2Hz，1H，td，)；C12-H(δ5.13，J=3.5Hz，1H，t)；C15-H(δ1.00，J=13.6，1H，brd)；C16-H(δ1.93，J=13.2，4.0，1H，td)；C29-H(δ0.81，J=6.2Hz，3H，d)；C30-H (δ0.91，J=6 Hz，3H，d)；13C-NMR(DMSO-d6) 示7个伯碳：δ28.3(C23)、16.1(C24)、15.2(C25)、17.0(C26)、23.3(C27)、16.9(C29)、21.1(C30)；9个仲碳：δ38.2(C1)、27.0(C2)、18.0(C6)、32.7(C7)、22.8(C11)、27.5(C15)、23.8(C16)、31.2(C21)、36.3(C22)；7个叔碳：δ76.8(C3)、54.8(C5)、47.9(C9)、124.6(C12)、52.3(C18)、39.4(C19)、38.5(C20)；6个季碳：δ38.4(C4)、39.8(C8)、36.5(C10)、138.2(C13)、41.6(C14)、48.8(C17)；1个羧基碳：178.3(C28)。

　　以上光谱数据与文献值一致［7，8］，根据光谱数据确证样品为乌索酸。

　　2.2 乌索酸样品含量测定

　　2.2.1  对照品溶液配制精密称定乌索酸对照品 9.20 mg，置于10ml 量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，制成对照品溶液。

　　2.2.2  样品溶液配制精密称定乌索酸样品 8.12 mg，置于10 ml 量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为样品溶液。

　　2.2.3  检测波长的选择

　　取乌索酸对照品和样品溶液进样，在190～500 nm 波长范围进行光谱扫描，乌索酸在流动相中的最大紫外吸收波长均为 204.5 nm (见图2)，但由于流动相在短波长处有末端吸收，为了消除背景，提高信噪比，提取不同波长的色谱图进行比较，选择 210 nm 为检测波长信噪比高，峰形好，干扰小，最大限度地保证分析结果的准确。

　　2.2.4  色谱条件色谱柱为 Kromasil C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为乙腈-甲醇-水-磷酸（体积比168∶682∶150∶1.68）；流速 0.8 ml・min-1；检测波长 210 nm；柱温为 25℃ 。以乌索酸计，理论塔板数分别为 16 675 ，分离度为 1.924，对称因子分别为 0.998，外标法定量分析。

　　2.2.5  线性关系实验用微量注射器精密吸取乌索酸对照品溶液 1，2，6，10，14，18μl  进样分析，平行 3 次，按色谱条件测定峰面积，以对照品的进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得乌索酸回归方程为：Y=6.38×105X +1.84×104（r=0.999 6）。表明当乌索酸进样量在0.92～16.56 μg 之间时，线性关系良好。

　　2.2.6  精密度实验精密吸取乌索酸对照品溶液 10 μl 进样，重复 5 次，测得乌索酸峰面积RSD为0.80 %( n = 5)，本方法精密度良好。

　　2.2.7  重复性实验精密称取同一批乌索酸样品 5 份，配制样品溶液，吸取 10 μl 进样分析，测得乌索酸峰面积RSD为1.12 %( n = 5) ，本方法重复性好。

　　2.2.8  乌索酸含量测定吸取样品溶液 10 μl 进样分析，重复进样 5 次，样品中乌索酸的含量为99.61%。

　　3   讨论

　　泡桐是玄参科（Scrophulariaceae）落叶乔木，原产于我国，现有 9 个种，4 个变种［1］，国内分布广泛，资源丰富。毛泡桐叶中不仅乌索酸含量较高，而且其同分异构体齐墩果酸含量极低，经研究测定其叶中乌索酸含量高达7.5‰［9，10］，为乌索酸的开发开辟了新的原料路线。

　　采用“醇提凝析法”新工艺，从毛泡桐中提取分离乌索酸，仅以乙醇为溶剂，未加其它有机溶剂，采用自制的“YCXY- 1 号”除杂剂，有效去除脂类、类脂类、酚类及叶绿素等杂质，不仅提高了产品的安全性，而且简化了工艺流程，降低了生产成本，有利于乌索酸的富集和纯化，其含量达99.61%，得率达30.5%，具有制备量大，质量稳定，易于实现工业化生产等特点。

　　本研究选用乙腈-甲醇-水（体积比168:682:150）体系为流动相，发现当流动相洗脱速度达 0.8 ml・min-1 时，乌索酸与其同分异构体齐墩果酸达到了基线分离，但峰形拖尾，这是由于结构中的羧基存在解离现象，加入适量磷酸能有效抑制其解离，使拖尾现象得以改善，峰形尖锐对称。经多次预实验选定流动相为乙腈-甲醇-水-磷酸（体积比168∶682∶150∶1.68），流速为 0.8  ml・min-1。

　　乌索酸在流动相中的紫外吸收光谱显示其最大吸收波

　　长为 202.2 nm，但溶剂甲醇在短波长处亦有吸收，为减少干扰，且不至于降低检测的灵敏度，故确定 210 nm 为检测波长。

　　采用该实验建立的 RP-HPLC 法测定毛泡桐中乌索酸的含量，样品处理简单，无其它杂质的干扰，方法简便、快速，分离效果好，数据准确可靠，为相关植物中乌索酸含量的测定提供了科学的分析手段。

　　致谢：乌索酸的质谱、核磁共振谱由中国海洋大学药物研究所李英霞教授代测。

　　【参考文献】

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　　［6］陈 武,李开泉,熊筱娟,等.陆英抗肝炎活性成分的研究［J］.宜春医专学报,2000,12(4):239.

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　　［8］彭师奇. 药物的波谱解析［M］. 北京:北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社,1998.

　　［9］刘名权,邹盛勤,陈 武,等.正交试验法优选毛泡桐中乌索酸提取工艺［J］.宜春学院学报,2007,29(2):1.

　　［10］刘名权,邹盛勤,陈 武,等.超声辅助HPLC法测定毛泡桐中乌索酸和齐墩果酸含量［J］.微量元素科学,2007,14(5):19.