疏水层析实验（HIC）

蛋白质表面一般有疏水与亲水基团，疏水层析是利用蛋白质表面某一部分具有疏水性，与带有疏水性的载体在高盐浓度时结合。在洗脱时，将盐浓度逐渐降低，因其疏水性不同而逐个地先后被洗脱而纯化，可用于分离其它方法不易纯化的蛋白质。

疏水性蛋白质溶解于水溶液中时会发生自我聚集或自身相互作用。这种自我聚集是形成多种生物学相互作用的基础，如蛋白质的折叠、蛋白质-底物间的相互作用及蛋白质，通过细胞膜的跨膜运输。疏水作用层析可用于分析和制备规模的蛋白质纯化。

HIC 主要利用大分子中存在的疏水性区域与层析吸附剂上的疏水性配体结合。这种相互作用发生于有利于疏水相互作用的环境，如高盐浓度溶液。对于非极性分子，水(极性溶液)本身不是一种好的溶剂。

在这种环境下，蛋白质会发生自我聚集或者形成聚集体，使其自身处于最低的热力学能状态。在蛋白质发生自我聚集以前,水分子会在其每个分子周围形成高度有序结构。

在极性溶液中，非极性分子(如蛋白质)的自我聚集受到环境中净熵值增加的驱动。在蛋白质聚售过程中，暴露于极性溶剂的蛋白质疏水位点整体表面区域减少，从而形成缩小结构(高熵的)环境，这是一种更有利的热力学状态。

疏水层析不具备高分辨率，但其特性与离子交换层析互补，可用于纯化难以分离的蛋白质。

实例1:

鸡蛋溶菌酶和鲸肌球蛋白的同步分离纯化
采用 Pheny1 SepharoseHP 色谱柱，实现对鸡蛋溶菌酶和鲸肌球蛋白混合。

200 操作过程:

①用 5 倍柱体积的缓冲液 A(50mmol/L磷酸钠， pH 为 7.0;2molL)衡柱子，保证稳定。

②进样 1.5mL 品，用4倍柱体积缓冲液 A 冲洗柱子，用 0~100% 的缓冲液 B 进行梯度洗脱，洗脱体积大于 30 倍柱体积，收集取样1mL。

③用 4 倍柱体积的缓冲液 B(pH7.0，50mmoVL 缓冲)进行洗脱。流速控制: 2mL/min，测定在 280nm 吸光度值。

试剂：
10% 硫酸铵溶液、平衡缓冲液为 10 mmol/LNa2HPO4，/NaH2PO4，1.0 mol/L（NH2SO4（pH7.4）；洗脱缓冲液为 10 mmol/L Na2HPO4/NaH2PO4（pH7.4）、SDS-PAGE

材料：层析柱、色谱填料

仪器： pH计、匀质机、离心机、蛋白纯化仪

1．硫酸铵盐析取组织匀浆 30 g 溶于 60 ml 硫酸铵溶液（10%）中，搅拌溶解 4 小时，12000 g 离心 20 分钟；取上清液，缓缓加入硫酸铵粉末并不断搅动，使溶液达到 35% 的饱和度，常温静置 2 小时；12000 g 离心 20 分钟；

取上清液，继续缓缓加入硫酸铵粉末并不断搅动，使溶液达到 70% 的饱和度，常温静置 2 小时。12000 g 离心 20 分钟，弃上清液，将沉淀溶解后进行疏水层析。

2．疏水层析应先用小号柱子进行层析条件的摸索，包括层析介质、结合和洗脱条件等。先选用 2.6 cm x 10 cm 层析柱，平衡缓冲液为 10 mmol/L Na2HPO4，/NaH2PO4，1.0 mol/L（NH2SO4（pH7.4）；洗脱缓冲液为 10 mmol/L Na2HPO4/NaH2PO4（pH 7.4）。

选用 Phenyl Sepharose FF、Octyl Sepharose FF 和 Butyl Sepharose FF 三种疏水介质进行比较，梯度洗脱，流速为 0.2 ml/min。预实验完成，选择纯化效果最好的 Butyl Sepharose FF 介质、7.6 cm x 10 cm 层析柱，进行大量层析纯化。

3．纯度鉴定用 SDS-PAGE 鉴定纯化蛋白的纯度。同时应定量测定纯化产物的胰激肽释放酶活性。

4．实验结果分析 35% 饱和度的硫酸铵溶液沉淀可以除去粗品中的部分杂蛋白；再通过 70% 饱和度的硫酸铵溶液沉淀后，不但可以将胰激肽释放酶蛋白全部沉淀，同时可起到浓缩样品的作用。实验采用高离子强度缓冲液平衡，胰激肽释放酶吸附于疏水介质上，然后在低离子强度条件下洗脱。

实验中发现 Octyl Sepharose FF 吸附蛋白能力最弱，在洗脱初始阶段，大部分蛋白即被洗脱下来；PhenylSepharose FF 吸附蛋白能力最强，洗脱液离子强度很低的条件下大部分蛋白才被洗脱下来，这两种介质对分离胰激肽释放酶蛋白的效果都不明显。

Butyl Sepharose FF 介质疏水性适中，可以保证温和条件下洗脱胰激肽释放酶。SDS-PAGE 分析结果表明盐析后经过一步疏水层析提纯，得到比活性大于 500U/mg 的胰激肽释放酶蛋白，电泳胶银染色显示有分子量在 28 kDa 左右的条带，符合预期。

1、在样品上样于层析柱之前，必须采用高浓度盐的缓冲液提高蛋白质混合物(将要采用 HIC 吸附剂纯化的样品)的盐浓度，目的在于使目标蛋白质能够与吸附剂结合。

2、蛋白质在高盐浓度下可能发生沉淀，所以，在选择盐溶液之前，应先评估蛋白质复合物在给定盐溶液中的溶解性。

3、缓冲液的 pH 对于蛋白质结合于 HIC 吸附剂的影响并不呈一般性的趋势，但是可以影响相互作用的强度。选择缓冲液的 pH，应该确保蛋白质和吸附剂在该环境下能够稳定(如避免使用极端 pH 溶液)。

4、在调整蛋白质上样的步骤中，盐的浓度可以为 05~20mol/L，并且可提高浓度以确保蛋白质能够有效结合于吸附剂。

5、蛋白质结合于吸附剂所需要的盐浓度在很大程度上取决于盐种类的选择。如部分所述盐种类。在大多数情况下，选择蛋白质结合于吸附剂的适合盐浓度需进行相关的预实验。蛋白质结合于吸附剂上之后，必须再将目标蛋白质洗脱，并收集层析柱柱后的流出液。多数情况下，洗脱过程用于将不需要的蛋白质从目标蛋白质中分离或者去除。不需要的蛋白质可能与吸附剂结合的不是那么紧密,因而会先干目标蛋白质被洗脱。

另外一些情况下，不需要的蛋白质会与吸附剂结合更加紧密，并会在目标蛋白质被洗脱之后仍与吸附剂结合。这种情况通常发生在 HIC 分离蛋白质多聚体时，目标蛋白质多聚体与吸附剂的结合比单体与吸附剂的结合更加紧密。在洗脱步骤中，流出液组分可能含有高纯度产品,但在其之前或之后也会含有大量的不需要的蛋白质杂质。

1、蛋白质在高盐浓度下可能发生沉淀，所以，在选择盐溶液之前，应先评估蛋白质复合物在给定盐溶液中的溶解性。

2、缓冲液的 pH 对于蛋白质结合于 HIC 吸附剂的影响并不呈一般性的趋势，但是可以影响相互作用的强度。选择缓冲液的 pH，应该确保蛋白质和吸附剂在该环境下能够稳定(如避免使用极端 pH 溶液)。

3、可加少量还原剂或者去污剂防止蛋白聚集。

4、蛋白低盐洗脱后尽快换至稳定缓冲液中。