蛋白纯化实验宝典

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Strep-tag®技术来源于德国IBA Lifesciences 公司。利用Strep-tag®技术，可纯化得到高纯度的Strep标签蛋白，杆状病毒、哺乳动物细胞、酵母和细菌表达系统皆可使用。耐受不同的缓冲条件和添加剂（高盐、洗涤剂、还原剂、金属离子和螯合剂）。标签与配体间高达pM级的亲和力使得其不仅用于重组蛋白的纯化，更适用于蛋白质-蛋白质相互作用分析。

通过生物分子之间的特异性相互作用来分离物质的一种层析方法。包括基于空间结构特异结合的抗原/抗体，酶/底物、底物类似物、抑制剂、激活剂、辅因子，激素/受体，核酸/核酸结合蛋白、互补核酸序列，和基于电子的供体和受体相互作用的金属螯合、嗜硫亲和等。该分离纯化蛋白的方法高效、简单、快速、选择性高。

蛋白质表面一般有疏水与亲水基团，疏水层析是利用蛋白质表面某一部分具有疏水性，与带有疏水性的载体在高盐浓度时结合。在洗脱时，将盐浓度逐渐降低，因其疏水性不同而逐个地先后被洗脱而纯化，可用于分离其它方法不易纯化的蛋白质。疏水性蛋白质溶解于水溶液中时会发生自我聚集或自身相互作用。这种自我聚集是形成多种生物学相互作用的基础，如蛋白质的折叠、蛋白质-底物间的相互作用及蛋白质，通过细胞膜的跨膜运输。疏水作用层

分子筛色谱又称凝胶排阻色谱、凝胶过滤和排阻层析，是 20 展来的一种新型的液相层析分离纯化方法。它的分离基础主要根据物质分子大小不同而进行。分子筛色谱所用的基质我们通常称之为好胶，它是具有立体网状结构且呈珠状的颗粒物质，每个颗粒犹如一个筛子，当将混合物样品加入层析柱进行洗脱时，大分子物质不多孔凝胶基质能进入基质内部而沿颗粒间的空隙随着溶剂流动，由于其流程较短，移动速度快而最先流出柱外;小分子物质则

离子交换层析（IEC）用于蛋白质分离的原理的是基于带相反电荷分子间的相互吸引力，其中蛋白质表面所带的电荷取决于蛋白质 pI 和环境 pH。蛋白质的保留时间和盐浓度决定了其与基质表面相互作用的结合位点数量。一般在低盐浓度时使蛋白质结合，而在高盐浓度时洗脱蛋白质。等度洗脱的洗脱窗口很低，因此通常以线性盐浓度梯度洗脱蛋白质。

pAcHLT-A-、B-、C-转移载体（Pharmingen）和 pBlueBacHis-A-、B-、C- 载体 (Invitrogen) 在多克隆位点（MCS）前存在编码6个组氨酸残基的 N 端标签的 DNA 序列。每个载体的 MCS 含有不同可读框，可简化克隆。表达的重组蛋白为 6 × His 融合蛋白，可用 Ni-NTA 琼脂糖进行纯化。

可进行离子交换的蛋白质在实验条件下必须有单一电荷。溶液中单一电荷的蛋白质可被离子交换树脂上的小离子置换（指与蛋白质末端离子的交换）；固定在树脂上。通过提高溶液中相反离子浓度或降低蛋白质所带电荷数等方法可将蛋白质从树脂上洗脱下来。利用此法，可根据不同蛋白质电荷性质不同而将其分离开来。若已知蛋白质的等电点，蛋白质分离的起姶策略就很容易制定了。如果是未知蛋白质，通过离子交换预实验可得到很多关于蛋白质的生

材料 缓冲液和溶液 贮存液、缓冲液和试剂的成分参见附录 1。 贮存液稀释至适当浓度。 二硫苏糖醇（1mol/L) 谷胱甘肽洗脱缓冲液 10mmol/L 还原型谷胱甘肽 50 mmol/LTris-Cl(pH8.0) 磷酸缓冲钠盐溶液（PBS)(4°C) TritonX-100(0.2%V/V) 酶和缓冲液 DNase(5 mg/ml) 溶菌酶 RNase(5 mg/ml) 凝

凝胶过滤层析是根据蛋白质分子大小不同而达到分离效果的，凝胶过滤填料中含有大量微孔，只允许缓冲液及小分子量蛋白质通过，而大分子蛋白质及一些蛋白复合物则被阻挡在外。因此，高分子量的蛋白质在填料颗粒间隙中流动，比低分于量蛋白更早地被洗脱下来。最大的蛋白质分子最早流出柱子，因为它们在到达柱底前经过的体积最小。中等大小的蛋白质可以进人填料分子中较大的孔内，因此它们晚一些到达柱底，而小蛋白质可以逬人所有填料的