基本方案 含 6 × His 标签

pAcHLT-A-、B-、C-转移载体（Pharmingen）和 pBlueBacHis-A-、B-、C- 载体 (Invitrogen) 在多克隆位点（MCS）前存在编码6个组氨酸残基的 N 端标签的 DNA 序列。每个载体的 MCS 含有不同可读框，可简化克隆。表达的重组蛋白为 6 × His 融合蛋白，可用 Ni-NTA 琼脂糖进行纯化。

1. 用扩增的重组病毒感染适当数量的细胞（如每个 100 mm 培养皿中 5×10⁶ 细胞），MOI 为 5～10。培养 3～5 天，直到细胞出现典型的病毒感染状态。

2. 用无菌吸管轻轻吹打细胞，收集细胞和上清液，转移到离心管中。

3. 4℃， 1000 g 离心 10 min。如果目的蛋白为分泌性蛋白，将上清转移到新管中，进行纯化（步骤 6)。如果目的蛋白为胞内蛋白，弃上清，洗涤细胞，将细胞沉淀在 PBS 中重悬，离心，弃上清。

4. 每 1 × 10⁷ 细胞加入 1 ml 含 1 × 蛋白酶抑制剂的昆虫细胞裂解液，在冰上放置 45 min。

裂解缓冲液根据细胞类型的不同而不同，6 × His 融合产物不能用含 EDTA 的裂解缓冲液。

5. 通过 4℃，40000 g 离心 30 min，澄清裂解液，沉淀为细胞碎片；或将裂解液过 0.2/nm 的滤器。

6. 轻轻的重悬 Ni-NTA 琼脂糖，将其倒入适当的层析柱中，使树脂自然沉降，柱中液体流尽，然后用 3～5 倍的 6 × His 洗涤缓冲液洗柱 2 次，以去除附着的乙醇。让柱中液体流尽。每 1 ml 的 Ni-NTA 琼脂糖可吸附 5～10 mg 6 × His 融合蛋白。

7. 将澄清的裂解液上柱，调整柱的流速，最大为每小时 5 倍柱体积。

8. 用 10 倍床体积的 6 × His 洗涤缓冲液洗柱，柱中液体流尽，同时测量 A₂₈₀ 的值。继续洗柱（大约 4 次），直到流出液的 A₂₈₀<0.01。弃洗液。

9. 加入 3 倍床体积的 6 × His 洗脱缓冲液（含有一阶梯度或线性梯度的咪唑），将流速调至 1 ml/min 每毫升树脂。分别收集洗脱液直到柱中液体流尽。

使用 BioColors-His 杆状病毒转移载体（Pharmingen）生产的融合蛋白，其目的基因含有 GFP和组氨酸标签。在紫外光下，整个纯化过程中，重组融合蛋白是可见的，这有利于建立最佳的纯化过程。

裂解缓冲液根据细胞类型的不同而不同，6 × His 融合产物不能用含 EDTA 的裂解缓冲液。