提问
提问
我要登录
|免费注册
点赞
收藏
wx-share
分享

🔥 离子交换层析实验(IEC)

相关实验:离子交换层析实验

别名:离子交换层析,离子交换色谱

最新修订时间:

丁香实验推荐阅读

合作专家 | 周康硕士

分子生物学 安徽农业大学

原理

离子交换层析(IEC)用于蛋白质分离的原理的是基于带相反电荷分子间的相互吸引力,其中蛋白质表面所带的电荷取决于蛋白质 pI 和环境 pH。蛋白质的保留时间和盐浓度决定了其与基质表面相互作用的结合位点数量。一般在低盐浓度时使蛋白质结合,而在高盐浓度时洗脱蛋白质。等度洗脱的洗脱窗口很低,因此通常以线性盐浓度梯度洗脱蛋白质。

用途

根据蛋白质表面电荷的不同,分离纯化目的蛋白。

材料与仪器

试剂:氯化钠溶液、平衡缓冲液(20mMTris,pH8.0)、洗脱缓冲液(20mMTris+1MNaCL,pH8.0)、SDS-PAGE

材料:层析柱、色谱填料

仪器:pH 计、匀质机、离心机、蛋白纯化仪

步骤

一、IEX 分离

将 IEX 介质填充到柱中以形成填充床,然后用填充基质孔隙和颗粒之间空间的缓冲液平衡床。

二、平衡

1、将固定相平衡到所需的起始条件:当达到平衡时,所有固定相带电基团都与可交换的反离子(例如Na+ 或 Cl-)结合。

2、选择起始缓冲液的 pH 值和离子强度,以确保在上样时,介质与目标蛋白质结合,尽量避免与杂质结合。

三、上样和清洗

1、结合目标分子:样品缓冲液应具有与起始缓冲液相同的 pH 值和离子强度,以结合所有带电靶蛋白。带相反电荷的蛋白质与 IEX 介质的离子基团结合,集中在色谱柱上。

2、洗掉所有未结合的材料:不带电荷的蛋白质或与离子基团具有相同电荷的蛋白质以与缓冲液流速相同的速度通过色谱柱,在上样期间或之后洗脱,具体取决于上样的总体积。

四、洗脱

当所有样品都已上样并用起始缓冲液清洗柱子以使所有未结合的蛋白质都通过柱子时,改变条件以洗脱结合的蛋白质。最常见的是,通过增加缓冲液的离子强度(盐浓度)或偶尔通过改变 pH 值来洗脱蛋白质。

注意事项

1、蛋白质在低盐浓度下可能发生沉淀,所以,在选择盐溶液之前,应先评估蛋白质复合物在给定盐溶液中的溶解性。

2、离子交换剂的选择

必须根据各类离子交换剂的性质以及待分离物质的理化性质,选择一种最理想的离子交换剂进行层析分离。选择离子交换剂的一般原则如下:

① 选择阴离子或阳离子交换剂,决定于被分离物质所带的电荷性质。如果被分离物质带正电荷,应选择阳离子交换剂;如带负电荷,应选择阴离子交换剂;如被分离物为两性离子,则一般应根据其在稳定性质来选择交换剂的种类。

蛋白质属于两性电解质,所带电荷取决于所处缓冲液的 pH 大小。当蛋白质等电点大于其所在缓冲液 pH 时,蛋白质带正电荷,应选用阳离子交换剂;当蛋白质等电点小于其所在缓冲液,蛋白质带负电荷,应选用阴离子交换剂。

② 强型离子交换剂适用的 pH 范围很广,所以常用它来制备去离子水和分离一些在极端 pH 溶液中解离且较稳定的物质。弱型离子交换剂适用的 pH 范围狭窄,在 pH 为中性的溶液中交换容量高,用它分离生命大分子物质时,其活性不易丧失。

强酸性阳离子交换树脂虽然可与很多阳离子交换,但对正电荷的胶体和高分子阳离子都不易吸附或吸附很少,所以一般用弱酸性树脂分离碱性蛋白质。强、弱型离子交换剂的交换容量与适用 pH 范围的比较。

③ 离子交换剂处于电中性时常带有一定的反离子,使用时选择何种离子交换剂,取决于交换剂对各种反离子的结合力。为了提高交换容量,一般应选择结合力较小的反离子。据此,强酸型和强碱型离子交换剂应分别选择 H 型和 OH 型;弱酸型和弱碱型交换剂应分别选择 Na 型和 Cl 型。

④ 交换剂的基质是疏水性还是亲水性,对被分离物质有不同的作用性质,如吸附、分子筛、离子或非离子的作用力等。

常见问题

1、蛋白质在低盐浓度下可能发生沉淀,所以,在选择盐溶液之前,应先评估蛋白质复合物在给定盐溶液中的溶解性。

2、缓冲液的 pH 对于蛋白质结合于 IEX 吸附剂的影响并呈一般性的趋势,可以影响相互作用的强度。选择缓冲液的 pH,应该确保蛋白质和吸附剂在该环境下能够稳定(如避免使用极端 pH 溶液)。

3、可加少量还原剂或者去污剂防止蛋白聚集。

4、蛋白高盐洗脱后尽快换至稳定缓冲液中。

来源:丁香实验

提问
扫一扫
丁香实验小程序二维码
实验小助手
丁香实验公众号二维码
关注公众号
反馈
TOP
打开小程序