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蛋白纯化实验宝典

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问蛋白纯化中始终去不了的杂带怎么解决？

huarenqiang5

1、在平衡缓冲液里加一些盐,0.2-0.5MNaCl，这样可降低一些因离子作用带来的非特异吸附。2、同时在平衡液里加0.5%吐温等表面活性剂。3、可以用阶段洗脱的方法,例如用5mM和10mM还原谷胱甘肽去分别去洗脱。4、注意的问题是超声破碎时注意功率和时间，避免过强时间过长，降解蛋白。5、如果是降解造成的，可以加点酶的抑制剂。

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问蛋白脱盐纯化问题

dxyc42u

先确认分子筛本身没有问题。如果是多种蛋白质的混合物，也能确定是哪一种蛋白的聚合体，要带着蛋白质的MARK，靠电泳分析手段来初步确定。还有一种原因应该是蛋白质和其他杂质结合造成，做电泳的时候则电泳条带一致（多在粗纯时出现）

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问纯化好的蛋白怎么才能保持时间久一点？

府宅

短期保存（1周内）：对于短期保存，大多数蛋白可以保存在4 摄氏度下。4摄氏度下保存面临最大的问题是微生物的污染。因此，如果保存时间超过24小时，建议利用0.22 um的滤膜过滤样品，除菌后保存在无菌的管子中。值得注意的是，并不是所有的蛋白质都适合保存在4度下。长期保存：对于长期保存，冷冻是必须的。蛋白质溶液在速冻后可以在-20度或-80度中进行，-80度下的蛋白可以保存更长久。长期保存蛋白质的另一

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问救助|本科科研萌新，纯化的蛋白大小与预期大小不符

冷泉港蛋白

有下面几个原因：1.如果是蛋白降解，在36KD应该有条带，你仔细观察下，看看有没有。比较下未诱导和诱导的差别2.可能是序列中间有终止密码子，你看下测序结果。3.这种分析，最好有图

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问在蛋白质纯化时，用PH2.0的酸性buffer洗脱，为什么不担心蛋白会遇酸沉淀？

豪杰6MBA

ph=pl ，打到蛋白质等电点蛋白会产生沉淀，ph2.0应该是过了蛋白的等电点,所以不会产生沉淀。

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问抗体纯化怎么设计实验方案，用什么方法纯化比较好？

灵枢天问

抗体纯化盐析法　　取x ml血清加x ml生理盐水，于搅拌下逐滴加入2x ml饱和硫酸铵，硫酸铵的终饱和度为50%。　　4℃，3h以上，使其充分沉淀　　　　离心（3000rpm）,20min,充上清，以x ml生理盐水溶解沉淀，再逐滴加饱和硫酸铵x/2ml。　　置4℃3h以上，[此时，（NH4）2SO4的饱和度为33%]　　重复上述第二步过程1～2次。末次离心后所得沉淀物为球蛋白，以0.02% m

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问蛋白纯化

土井挞克树

可能是形成聚合体了，所以跑出来的蛋白比较大

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问抗体纯化的方法怎么选择

府宅

固定化金属螯合亲和层析法：配体稳定性高，吸附量大，洗脱条件温和，但同样也更加复杂，因为需要额外的步骤固定金属离子。离子交换层析法：离子交换层析是一种较为常见并被广泛使用的抗体纯化方法。尺寸排阻色谱法：可用于DNA，蛋白质的纯化，缓冲液更改，脱盐等。疏水作用层析法：与蛋白质的作用比较温和，所以能够更好地保持生物大分子的天然结构和生物活性，同时疏水作用也非常擅长从大体积样品中提取低含量的目标蛋白。

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问链霉亲和素的表达纯化

土井挞克树

脱盐部分浓度太高会导致蛋白聚化，建议降低浓度

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问分子伴侣共表达的蛋白纯化

Eason老歌迷

通常机器用线性方法洗脱蛋白这样方法有的时候并不能得到好的纯化效果，可选择不同浓度的咪唑做阶段洗脱，此外可用盐酸胍代替尿素试一试。

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问请问怎样分离和提纯Igf2呀

sswei

采用层析色谱结合生化提取的方法。

3 回答341 围观

问蛋白在纯化时，如何定量？

Eason老歌迷

蛋白质含量方法常见的有以下四种。根据物理性质：紫外分光光度法。据化学性质：凯氏定氮法、双缩脲法、Folin-酚试剂法（Lowry法）、BCA法、胶体金法。根据染色性质：考马斯亮蓝染色法、银染法。根据其他性质：荧光法。我们实验室更喜欢用考马斯亮蓝染色法。

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问带MBP标签的蛋白纯化

loveliufudan

MBP标签通常被用于帮助纯化目的蛋白，但是有时MBP标签本身会从目的蛋白中脱离。这可能是由于以下原因之一：蛋白结构域：MBP标签可能位于目的蛋白的结构域中，这可能导致MBP标签在纯化过程中被蛋白酶剪切或脱离。蛋白不稳定：目的蛋白可能不稳定，并且在纯化过程中会失去MBP标签。未正确装配：MBP标签可能未正确装配到目的蛋白中，导致MBP标签在纯化过程中被去除。纯化条件不当：使用的纯化条件可能不适合MB

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问用新的镍珠纯化蛋白，目的蛋白为什么挂不上珠？

天一湖医者

1. 因为 His标签被包到了蛋白三维结构里面。镍介质无法接触His 标签；2. 纯化工艺不利于结合作用发挥，例如咪唑；3. 蛋白不稳定，标签掉落

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问提高蛋白质纯化的成功率有什么好的经验分享？

一个小哭包

蛋白质纯化工艺中的其他因素也会对蛋白质的稳定性产生影响。对蛋白质的处理步骤越少越好，在最短时间内采用最少步骤的纯化工艺才能保证得到最高产率的活性蛋白质。而且，在整个纯化过程中，蛋白质最好都保持在低温状态。一般纯化过程都在4°C进行,因为这个温度既可以降低酶解速度（在含有蛋白酶的情况下），又可以保证蛋白质的结构完整性。

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问原核纯化蛋白，IP纯化后的目的带比破碎后的上清的带弱，是什么原因

天一湖医者

是否考虑上样量过小，可增加上样量、降低一抗稀释度并延长曝光时间

2 回答310 围观

问原核表达蛋白纯化问题

丁香粉猪猪

一些蛋白质或 DNA 与带有标签的目的蛋白发生了非特异性相互作用，可以用低浓度的去污剂（2%的 TritonX-100 或浓度不大于 0.5%SDS)洗涤样品（上样洗脱时）或增加洗脱液的盐浓度（氯化钠溶液低于 2mol/L）。柱子没平衡好，平衡缓冲液没加咪唑，平衡液 PH 不适合，缓冲液 pH 要与蛋白质 pI +/-1-2

3 回答658 围观

问蛋白纯化时发现沉淀出现问题？

Eason老歌迷

硫酸铵沉淀是很粗的分级方法，建议你精纯的话还是要过柱子的。

4 回答405 围观

问his标签的蛋白过柱子，洗脱不下来，洗脱液咪唑浓度已经达到0.5M。

灵枢天问

如果不好洗的话，那就得再加一点咪唑，我们可以提到0.8

2 回答762 围观

问弥散性糖基化蛋白纯化后大小变了

illusio

有可能是蛋白降解了，蛋白降解了会出现多带现象，或者蛋白有其他修饰形式比如甲基化、磷酸化

3 回答363 围观

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