抗体纯化怎么设计实验方案，用什么方法纯化比较好？

抗体纯化三步法

STEP 1 捕获

亲和层析

从初始样品中（细胞原液）分离抗体，这步骤主要是中和pH上样，低pH洗脱的，把单抗从培养液中快速地捕获出来的最关键步骤，此步骤可以去除大量的HCP，单抗去折叠片段，病毒及HCD和培养基组分物质.

STEP 2 精纯

强阳离子离子交换层析（结合/洗脱模式）

阳离子交换层析在纯化工艺中起着非常重要的作用，可以达到很好的去除杂质效果，进一步去除HCP，脱落的ProteinA，抗体聚集体，片段及其他异构体。

STEP 3 精纯

强阴离子交换层析（流穿模式）

大部分单抗PI值大于7，在中和pH上样条件下大部分蛋白带正电荷，流穿下来，这步操作不仅能去除杂质蛋白，聚集体，内毒素，最重要的是能去除病毒，更进一步提高药物安全性。因大部分病毒在pH>7缓冲条件下带负电荷，可以和带正电荷的季铵阳离子结合，从而达到消除病毒的作用。

实验手册介绍了几种方法，希望对你有帮助：

1.盐析法（饱和硫酸铵沉淀法）
该纯化方法是基于在待纯化免疫血清中加入饱和硫酸铵溶液，由于抗体也是一种蛋白质，其在水溶液中的溶解度是由其本身携带的亲水基团数和电荷数决定的，当我们向抗血清中加入饱和硫酸铵溶液后，硫酸根离子和铵根离子与抗体竞争溶液中的水分子，因为硫酸根离子和铵根离子与抗体分子相比，具有更强的亲水性，因此抗体分子表面的水化膜被破坏，同时其暴露出来的带电基团被溶液中的盐离子所中和进而导致其溶解度大大降低，依据此原理从而将其从抗血清中分离。
2.正辛酸-饱和硫酸铵沉淀法
该纯化方法原理是：正辛酸在偏酸条件下，能与抗血清中或者小鼠腹水中的杂蛋白结合，在等电点附近将其沉淀，IgG类抗体则存在于上清液中，再利用饱和硫酸铵沉淀法即可进一步提纯。
3.Protein A和protein G纯化法
基本原理：protein A和proteiin G 可以和抗体IgG分子的Fc段特异性结合。Protein A和protein G 作为配基可以被偶联到琼脂糖凝胶上，当抗血清从中流过时，特异性的IgG就与配基结合，其他杂蛋白则穿流而过。因两种蛋白纯化抗体时对不同宿主的抗体的结合能力不同，我们需要具体情况具体对待，分别选择protein A 或者protein G,或者是protein A/protein G组合。一般推荐小鼠单抗IgG2a,IgG2b,IgG3，兔，人，猪的多克隆抗体用protein A纯化，而小鼠单抗IgG1, 大鼠单抗，小鼠，大鼠，山羊的多克隆抗体则选择用protein G纯化。
4.免疫亲和纯化法
基本原理：将抗原作为一种配基偶联在sepharose 4B上，血清等生物液体中的特异性抗体与sepharose 4B上的抗原进行特异性结合，其他杂蛋白和杂抗体则不被结合，通过洗涤和洗脱等一系列实验步骤即可得到高纯度的目标抗体。本方法虽然和Protein A/G均被称为亲和纯化方法，但是纯化得到的最终的抗体还是有很大区别的，Protein A/G纯化得到的主要是非特异性的IgG类抗体，而本方法纯化得到的主要是特异性的IgG类抗体，与其他纯化方法相比，本方法纯化得到的抗体其特异性最强，纯度最高。本纯化方法的实验步骤与protein A/G纯化方法基本一致，将实验方法三的配基protein A/G换成相应的目标抗原即可。

随着生物下游加工技术的不断发展，各种生物大分子特别是抗体大分子的分离纯化方法也越来越多，比如分子筛层析(凝胶层析或凝胶过滤)，离子交换层析等等也在实验中被用到。以上介绍的只是一般IgG类抗体的纯化方法，其他IgM,IgA，IgD,IgE等抗体的纯化方法要依据各自性质的不同选择符合其自身特点的纯化方法。

硫酸铵沉淀法

(1)准备一份饱和硫酸铵(AS)溶液(4.lmol/L)(向血清或者腹水中加人等量的饱和AS溶液，此时溶液的饱和度达到50%，抗体将会被沉淀。

(2)沉淀前，2500r/min离心腹水或血清15～30min，使原液澄清，将血清或腹水转入一个清洁的烧杯中，放入一个磁力搅拌子，将其放置在磁力搅拌器上搅拌。

(3)加入与原液等体积的饱和AS溶液。缓慢加人硫酸铵使其与腹水或血清混合。等出现的沉淀溶解后再加人更多的AS。当已经要基本加完所有的AS时将会出现不溶解性沉淀。继续加完所有的AS。让溶液在4℃继续混合6～24h。

(4)沉淀完成后，3000g离心溶液30min，弃上清(保留弃液样品作为后期的检测)。缓慢加入150mmo1/L PBS溶液于沉淀中，用移液枪轻柔搅拌混匀。加人足够的PBS，其体积相当于原液的25%～50%。

(5)将溶解的预处理抗体用20倍体积的PBS溶液透析。由于AS的高盐浓度，建议至少每2h更换～次透析缓冲液，更换3次。

(6)对终产物进行蛋白质浓度测定、区带电泳、密度扫描以及特异性检测。这些检测结果将显示抗休的纯化水平及活性。

(7)纯化抗体应该小份量分装并一70℃保存。

抗体纯化盐析法

　　取x ml血清加x ml生理盐水，于搅拌下逐滴加入2x ml饱和硫酸铵，硫酸铵的终饱和度为50%。

　　4℃，3h以上，使其充分沉淀　　

　　离心（3000rpm）,20min,充上清，以x ml生理盐水溶解沉淀，再逐滴加饱和硫酸铵x/2ml。

　　置4℃3h以上，[此时，（NH4）2SO4的饱和度为33%]

　　重复上述第二步过程1～2次。末次离心后所得沉淀物为球蛋白，以0.02% mol/L pH7.4PBS溶解至x ml装入透析袋。

　　对PBS充分透析、换液3次，至萘氏 试剂 测透析外液无黄色，即无NH4+为止。

　　取透析袋内样品少许作适当倍数稀释后，以751型紫外分光光度计测定蛋白含量。

　　影响盐析的因素很多，如蛋白质的浓度，盐的浓度，饱和度和pH，温度等都可影响盐析的结果，操作时要充分注意.