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用新的镍珠纯化蛋白,目的蛋白为什么挂不上珠?

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西凉河的迪迦

取新的镍珠,经过激活镍珠后纯化蛋白,发现目的蛋白表达了但没有挂上镍珠,20mM咪唑就把蛋白全部洗脱下来了,这是什么原因?

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2 个回答

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天一湖医者

有帮助

1. 因为 His标签被包到了蛋白三维结构里面。镍介质无法接触His 标签;

2. 纯化工艺不利于结合作用发挥,例如咪唑;

3. 蛋白不稳定,标签掉落

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迟C迟

有帮助

导致不挂柱的原因有二: 原因之一是有时候由于标签被包裹在蛋白结构内部导致目的蛋白不能挂柱,验证方法是给样品里加上尿素或盐酸胍变性,然后再变性条件纯化,看目的物是否能挂柱。 如果还不能挂镍柱,就需要考虑是标签表达问题了,需要先做一个weatern blot,用标签的抗体检测组氨酸是否被表达,挑到突变株未表达标签也会发生目的物不挂住的情况,这样也比较麻烦,需要重新构建克隆。

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