离子交换层析法

可进行离子交换的蛋白质在实验条件下必须有单一电荷。溶液中单一电荷的蛋白质可被离子交换树脂上的小离子置换（指与蛋白质末端离子的交换）；固定在树脂上。通过提高溶液中相反离子浓度或降低蛋白质所带电荷数等方法可将蛋白质从树脂上洗脱下来。利用此法，可根据不同蛋白质电荷性质不同而将其分离开来。

若已知蛋白质的等电点，蛋白质分离的起姶策略就很容易制定了。如果是未知蛋白质，通过离子交换预实验可得到很多关于蛋白质的生物物理信息并指导进一步的纯化处理。

1. 离子交换树脂的选择

阴离子交换树脂用于处理净电荷为负的蛋白质；阳离子交换树脂用于处理净电荷为正的蛋白质。DEAD 或 CM-Sepharose 等琼脂基的树脂对很多蛋白质都是适用的。

1.1 离子交换树脂的类型

离子交换树脂除了以阴、阳分类外，还分为强离子交换树脂和弱离子交换树脂。强离子交换树脂在大部分 pH 范围内离子化程度都很高，弱离子交換树脂在工作 pH 值时离子化程度则很低。强离子交换树脂用于离子交换中液相 pH 值很高或很低的情况。过去大多数层析试验都是用弱离子交换树脂进行的，但强离子交换树脂能提供更好的重现性。

一个重要的离子交换树脂是羟基磷灰石。它使用磷酸钙结晶作为离子交换剂，可处理酸性和碱性蛋白质。

1.2 层析速度

树脂的形态应使层析时液相流动速度适中，让蛋白质有足够的时间吸附在树脂上过髙的层析速度虽然可节约时间，但也会降低试验精度。

1.3 树脂吸附容量

树脂吸附容量是评估某种树脂处理蛋白质量的一种标准，其单位是毫克蛋白质/毫升树脂。可由它决定层析时使用树脂量。在高精度层析时最好只使用树脂最高吸附容量的 10％～20％。同样的树脂其吸附容量对于高分子量蛋白质要比对于低分子置蛋白质低，这是因为低分子量蛋白质与树脂的结合点更多。

1.4 树脂的溶胀

Sephadex 等一些材料会被高压所压缩，或在离子条件改变时膨胀或萎缩。这样的树脂需要再生。树脂的膨胀会使层析柱的处理复杂化。新的树脂材料大多数已克服了这一问題。

1.5 对 pH 值的稳定性

如果实验中 pH 值很低或很高，树脂一定要具有与之相当的稳定性。而且此时弱离子交换树脂的离子化程度会很小，应选用强离子交换树脂。

2. 树脂的准备和层析柱的填装

层析柱的准备可分三个步骤：（1）使干燥的树脂溶胀；（2）将树脂装入柱中；（3）用无蛋白质的样品缓冲液浸泡树脂达到交换平衡。为保持蛋白质的活性，试验可在 4℃ 下进行，此时所有设备和试剂均应冷却至 4℃，并于此温度储藏。

2.1 使树脂溶胀

商品树脂为干燥的粉末，必须用样品缓冲液浸泡使之溶胀，1 g 树脂在溶胀后体积可达 5～50 ml。

2.1.1 将干燥树脂以大约十倍体积量的样品缓冲液浸泡（如 10 g 树脂＋100 ml 样品缓冲液）。

2.1.2 煮沸 1 h 以上或浸泡若干小时至若干天，使树脂充分湿润。煮沸时适量多加入样品缓冲液，保证上样缓冲液不被煮干。

2.1.3 在溶胀过程中搅拌几次，保证树脂充分浸润。

2.1.4 溶胀过程中更换几次样品缓冲液，使交换到树脂内的成分与样品缓冲液成分差别不大。溶胀过程中不要使用搅拌磁子，它会将树脂打成小碎片。

2.2 将树脂装柱

在装柱之前，树脂即须用样品缓冲液浸泡以达平衡。浸洗树脂有时需要数十倍于柱体积的样品缓冲液，这样可以节约大量时间。装柱用的树脂凝胶应为一份体积干树脂与一份体积样品缓冲液的混合物。高精度层析时柱高应为柱直径的 4～5 倍，对一般层析而言，柱高只需为柱直径的 2 倍。在装柱时一定要非常谨慎。装柱必须一次性完成，否则会严重影响蛋白质分离的精度与重现性。一个树脂储存器可以提供足够一次性装柱的树脂量（见图 1）。

图 1　树脂存储器

2.2.1 在烧杯中用样品缓冲液浸洗树脂。搅拌 1 min， 测量 pH 值。若 pH 值与原样品缓冲液不同，倾泻掉大部分样品缓冲液，加入新样品缓冲液，重新搅拌和测量 pH 值。这一步骤叫部分平衡，它可以减少树脂在层析柱中正式平衡的时间；

2.2.2 若在室温下进行层析，将树脂真空抽气 1 h 以除去其中的小气泡，抽气时摇动层析柱有助于气泡的赶出；

2.2.3 在层析柱中加入少量样品缓冲液；

2.2.4 打开层析柱出口，导出少量上样缓冲液以赶出层析柱底部的空气；

2.2.5 摇匀树脂，用一根玻璃棒将其导入层析柱，不要带入气泡；

2.2.6 打开层析柱出口，在树脂堆积时加入更多的样品缓冲液；

2.2.7 可用一个适配器进行装柱。确定没有气泡进入柱中，它们会影响层析速度，甚至使层析停止；

装拄时，长层析柱可稍微倾斜。值得注意的是。一些树脂慢速装柱的效果比较好，这样的树脂有葡聚糖凝胶树脂等；而另一些树脂，如琼脂凝胶树脂，最好快速装柱。

2.3 使树脂达到交换平衡

装柱之后，用样品缓冲液最终润洗树脂，便其 pH 值和离子强度最终达到实验要求，并将树脂洗到基线水平。在这一步中使用的样品缓冲液一般不超过树脂体积的 10 倍。将样品缓冲液的 pH 值和电导率与洗脱液进行比较，确保树脂已达到平衡。

3. 样品上柱

3.1 样品的准备

样品溶液首先要通过离心分离或用 0.45 um 孔径滤纸过滤而成为澄清溶液。注意不要在这一过程中使目的蛋白损失。溶解蛋白质的样品缓冲液离子强度最好低于 50 mmol/L 可用凝胶过滤法、透析法或超滤法达到此目的。稀释蛋白质溶液也是可供选择的一个方法。

3.2 进样

3.2.1 打开层析柱底部出口，将上样缓冲液引入柱中，直至液面达到树脂表面。关闭层析柱底部出口；

3.2.2 用移液管将蛋白质溶液缓慢的加在树脂面上；

3.2.3 打开层析柱的出口，让蛋白质溶液进入树脂，当溶液表面与树脂表面重合时，关上层析柱的出口；

3.2.4 在树脂表面缓慢的滴加少许上样缓冲液；

3.2.5 重复步骤 3.2.3 的操作；

3.2.6 重复步骤 3.2.4 的操作，并将层析柱挂起；

3.2.7 之后就可以进行蛋白质的层析和洗脱了。

4. 洗柱和目的蛋白的洗脱

在洗脱任何结合蛋白质之前，使样品缓冲液持续流过离子交换树脂柱，可带走不与树脂结合的蛋白质，使之与吸附在树脂上的蛋白质分离。这一步骤一般要使用 3～10 倍于树脂体积的样品缓冲液。检测流出液的蛋白质浓度或光密度是必要的。当有微量蛋白质出现时，蛋白质的洗脱就应开始了。

如前所述，蛋白质的洗脱分为步进洗脱和梯度洗脱。步进洗脱时，每一阶段离子强度的增加不必一致，如用 NaCl 溶液洗脱时，可分三步洗脱，NaCl 浓度依次为：0.1 mol/L、0.5 mol/L、1.0 mol/L（见图 ２）。梯度洗脱时洗脱液的离子强度是逐渐增加的，如将洗脱液中的 NaCl 浓度从 0.02 mol/L逐渐增加到 1.0 mol/L（见图 ３）。梯度洗脱可便不同蛋白质的分离更沏底，而分步梯度洗脱可简化步骤；加快速度。但分步梯度洗脱离子强度变化过大时，一些蛋白质将无法分离。进行精确的蛋白质分离或两种蛋白质等电点相近时，梯度洗脱是必要的。步进洗脱可在预试验或目的蛋白洗出后采用。

4.1 步进式洗脱（图 ２）

4.1.1 在层析拄中通过 3～10 倍于树脂体积的洗脱液（如 20 mmoo/L Tris－HCl、0.1 mol/L NaCl 溶液）。

4.1.2 使洗脱液面与树脂床面平齐，这样可以保证在加入不同浓度的洗脱液时 NaCl 浓度的变化不出现偏差。

4.1.3 将洗脱液换为第二种浓度；重复 4.1.1、4.1.2 步橾作。

图 1　步进式洗脱的洗脱液吸光曲线

4.2 梯度式洗脱

梯度式洗脱的洗柱缓冲液总用量应为树脂床体积的 5～10倍。

4.2.1 将离子强度较低的洗脱液（20 mmol/L Tris-HCl,0.02 mol/L NaCl） 放在梯度仪离层析柱较近的一端，离子强度较高的洗脱液（20 mmol/L Tris-HCl，1.0 mol/L NaCl） 放在另一端。装洗脱液的两个容器应该一样，溶器中的液面高度也须相同。确保梯度仪中没有气泡。开动低浓度洗脱液容器中的电磁搅拌器，将梯度仪装在层析柱上。

4.2.2 用部分收集器收集洗脱液并检测其成分。

图 ３　梯度式洗脱的洗脱液吸光曲线