原理
用于亲和层析的凝集素应根据它们结合的特异性和紧密度加以选择。例如,刀豆素 A(Con A)与糖蛋白含有的葡萄糖或甘露糖结合,而麦芽凝集素只与具 N-乙酰葡糖胺的蛋白质结合。胞膜糖蛋白常与麦芽凝集素结合,而可溶性糖蛋白却通常用 Con A 或扁豆凝集素亲和柱纯化。由于在许多情况下被纯化的糖蛋白的结构和特性不清楚,所以筛选一些凝集素与目的蛋白的结合状况常常是有用和必要的。用于此目的的凝集素试剂盒也可购得。
凝集素亲和层析相对易于操作。可用许多方法将凝集素固相化到介质。溴化氰偶联是普遍采用的方法。每 ml 介质材料能偶联凝集素。偶联时含有适宜的二价离子(0.1 mmol/L)和保护性糖类(5%,w/v)是关键。保护性糖类在偶联过程中使结合部位不易接近而受到保护。许多凝集素亲和柱也可从市场购得。
以下步骤以介绍刀豆素 A 亲和柱纯化蛋白质为例,其他凝集素亲和柱的纯化步骤基本相似,只要换成适宜的洗脱用糖。相对长而细的层析柱有更好的分辨率,短而粗的柱子在小体积洗脱时具有更快的流速。小的试验柱(例如装填在巴斯德吸管内的)或在小离心管内进行的层析试验可用于估算柱的结合容量。
材料与仪器
甲基-α-D-甘露糖 NaCl NaN3 Tris-HCl NaCl Mncl2 CaCl2 辛糖苷
层析柱
步骤
1. 制备刀豆素 A 亲和柱;
2. 用 10 倍柱体积的层析缓冲液(20 mmol/L ,pH 8.0 Tris-HCl,0.15 mol/L NaCl,1 mmol/L MnCl2,1 mmol/L CaCl2,30 mmol/L 辛糖苷)平衡装好的亲和柱;
3. 糖蛋白样品液对层析缓冲液透析或用该缓冲液 1:1稀释,然后离心或过滤除去沉淀;
4. 将调整好的糖蛋白样品液上样到亲和柱;
5. 用层析缓冲液洗柱至 A280 值回到基线;
6. 用 5 倍柱体积含10 mmol/L 甲基-α-D-甘露糖的层析缓冲液洗脱;
7. 继续分别用 5 倍柱体积含 20、50、100、250和 500 mmol/L 甲基-α-D-甘露糖的层析缓冲液洗脱;
8. 检测目的蛋白组分。汇集的目的蛋白组分透析除去糖;
9. 用含 1 mol/L NaCl 的层析缓冲液洗柱,以获得再生;
10. 欲储存时,用含 0.02% NaN3 的层析缓冲液洗柱,肪止污染。
注意事项
来源:丁香实验