蛋白质内序列分析用肽段的分离与纯化实验

材料与设备

考马斯亮蓝 G(0.05% 的乙酸-20% 甲醇溶液）

乙酸 (5% 的 10% 甲醇溶液）

甲醇 (50% 的水溶液和 10% 的水溶液）

SpeedVac 型旋转浓缩器（Savant Instruments,Inc.)

Achromobacter 胰蛋白酶 I〔赖氨酰内肽酶;50ng/ul 的 0.1mol/LTri-HCl(pH9.0)〕

Tween-20〔0.1% 的 0.1mol/L Tris-HCl(pH9.0) 溶液〕

Ultrafree^TM MC 滤器（22um;Millipore Corp.)

三氟乙酸（TFA;0.1% 的 50% 乙腈溶液)

C18 反相 HPLC 柱 (2.1X250 mm;5um,300A)(VYDAC)

乙腈

2-丙醇

操作流程如下：

1) 用 SDS-PAGE 分离待研究蛋白。

2) 凝胶用 0.05% 考马斯亮蓝 G 染色 15~30 min。

3) 用含 5% 乙酸的 10% 甲醇溶液脱色。

4) 在水中浸泡 10 min。

5) 从凝胶上切下蛋白带，转移至微量离心管。切下一段不含蛋白质的凝胶作对照。如必要，可将凝胶切成较小的碎片，使之能容易地沉入微量离心管的底 部。

6) 各管加入 1 ml 50% 甲醇。室温下孵育 20 min。弃上清。

7) 各管加入1ml 10% 甲醇。室温下孵育 20 min。弃上清。

8) 凝胶碎片在 SpeedVac 型旋转浓缩器中干燥 2 min。

9) 各管加 10ul Achromobacter 蛋白酶 I。

10) 各管加最小体积的含 0.1%Tween-20 的 0.1mol/L Tris-HCl(pH9.0)—刚够淹没凝胶碎片即可。
注：凝胶碎片会膨胀, 故重要的是要保证它们仍能淹没在含去垢剂的缓冲液中。

11) 各管 30℃ 孵育 24 小时。

12) 各管在微量离心机中离心，将各管上清转移至 22-um Ultrafree MC 滤器内。12000r/min 离心 2 min。保留滤液。

13) 加 1 体积含 0.1%TFA 的 50% 乙腈溶液于各管留下的凝胶碎片中--足够淹没凝胶碎片。4°C 孵育 30 min。

14) 重复第 12、13 步操作。合并各样品的滤液。

15) 样品在 SpeedVac 型旋转浓缩器中旋转浓缩至体积小于 100 ml。加适量 HPLC 平衡液，制成供 HPLC 分析用的样品。

16) 用反相 HPLC C18 柱分离消化液中的肽段。用含 0.09% TFA 的乙腈/2-丙醇 (3:1) 梯度洗脱肽段。于 214mn(对肽键）和 295nm(对色氨酸）检测肽段的 UV 吸收。