DNA的提取和纯化

<font>1 DNA提取<br /> ⑴ 新鲜外周静脉血3~5ml，以ACD（柠檬酸纳缓冲液）1/7体积抗凝；<br /> ⑵ 3500rpm 15分钟离心，吸除上层血浆；<br /> ⑶ 加5倍体积蒸馏水（灭菌），摇匀，静置5~10分钟，3500rpm15分钟离心，去上清，（若沉淀不够，可重复1~2次）；<br /> ⑷ 吸取沉淀（少许液体）放入1.5ml离心管，STE 清洗2次；12000rpm 7~8分钟离心；<br /> ⑸ 去上清后加0.5mlSTE，10%SDS 25~30ml，蛋白酶-K 5μl（100μg/ml）37℃消化过夜，直至沉淀物溶解为止；<br /> ⑹ 等体积饱和酚，倒转摇匀10分钟。12000rpm 5分钟，离心，吸上层入另一1.5ml离心管；勿吸入蛋白层；<br /> ⑺ 上清液加等体积酚：氯仿：异戊醇（25：24：10），倒转混匀10分钟。12000rpm 5分钟，离心，吸上层入另一1.5ml离心管；<br /> ⑻ 上清液加等体积氯仿：异戊醇（24：1），倒转混匀10分钟，12000rpm5分钟，取上清入另一管；<br /> ⑼ 加1/12体积3M 醋酸钠，混匀后再加3倍体积的4℃无水乙醇，轻柔振摇；应出现白色絮状物（DNA）；于-20℃放置20~30分钟，12000rpm 低温（4℃）离心10分钟，沉淀DNA，去上清；<br /> ⑽ 加1ml 70%乙醇洗涤，12000rpm 低温（4℃）离心10分钟，去上清，重复1次；<br /> ⑾ 自然干燥后，用pH8.0TE溶解，保存在-20℃备用。<br /> <br /> 2 DNA浓度的测定取15ul DNA 标本加1485μl 双蒸水，充分混匀后，用紫外分光光度计测定波长分别为260nm、280nm、330nm时的OD值，计为OD260、OD280、OD330，计算浓度和比值，判断DNA的浓度和纯度。<br /> DNA浓度（μg/ml）=（OD260-OD330）×50μg/ml×稀释倍数（100）<br /> DNA纯度=（OD260-OD330）/（OD280-OD330）<br /> 若DAN纯度<1.6, 表明有残存酚或蛋白含量太高，用氯仿抽提纯化。<br /> <br /> 3 DNA的纯化<br /> ⑴ 加等体积氯仿；异戊醇，轻轻振摇5分钟，12000rpm低温离心5分钟，吸取上层水相至另一EP管；重复一次；<br /> ⑵ 加入1/12体积的3M NaAC，混匀，再加入2.5倍体积无水乙醇沉淀DNA；12000rpm低温离心5分钟，去除上清；<br /> ⑶ 加1ml 70%乙醇洗涤，12000rpm 低温离心10分钟，去上清；重复1次；<br /> ⑷ 真空干燥，加适量TE溶解，置4℃备用。<br /> </font>