大分子量膜蛋白转膜条件

分子量在210kDa的细胞膜蛋白，0.45NC膜，0.22PDVF膜都用过，转膜试过300mA，3h/2.5h，内参是100kDa的膜内参，5%上胶，8%下胶，都做不出来结果。现有以下疑问，1，是否需要借助试剂盒提取蛋白？抗体售后怀疑我没有提到目的蛋白2，牛奶封闭1h可以吗？3，转膜液我没有加甲醇，加了1gSDS，这里是否加0.5g就行了即浓度0.05%就可以了,4，转膜条件用多少恒流过夜？还是90V 3h？5，二抗用的10:1000是不是浓度不行？