western抗体孵育时间

一抗孵育时间和抗体浓度有关，如果是首次使用的抗体，过夜四度（12-16 h ）都可以，如果孵育时间过长会导致背景比较深

4度摇床过夜（14h）条带好看

封闭，一抗和二抗的孵育时间和所用稀释液，孵育温度都有关系，如果普通的稀释液4℃可以封闭5小时，一抗过夜，二抗3-4小时，室温则大大缩短，如果用快速封闭液按说明书封闭即可，此外和抗体的新鲜程度也有关系。

western blot 一抗孵育时间过长当然有影响的，一抗孵育时间太长容易导致非特异性吸附加深

一般可以室温孵育三十分，然后四度过夜。或者选择室温孵育2小时直接二抗。因为洗膜洗去的是未结合的抗体，抗体结合上就不容易洗掉了。洗膜不完全背景会深，但洗膜时间延长并不能完全去除背景。

1.首先建议仔细查看抗体试剂的说明书，全面掌握孵育的时间和温度等条件，考虑使用同一个厂家的配套试剂。

2.每一种试剂作用之后的洗涤过程，都需要标准操作，用力过猛或时间过久可能导致假阴性反应，而洗涤时间过短、冲洗不充分会导致假阳性反应。

3.设置阳性对照，监控抗原抗体反应和显色的过程，以便分析结果和过程中可能存在的问题。

我们一般是一抗一个小时，二抗一个小时，洗的话每次10分钟，共三次

封闭最少40min可以，一抗一般四度过夜，洗10min洗3，二抗室温2h足矣。时间长点也可以。但是二抗孵育太长，容易黑，如果想长就放四度

封

一抗孵育温度有几种：4度、室温、37度，其中4度效果最佳；孵育时间与温度、抗体浓度有关，一般37度1-2h，4度过夜（从冰箱拿出后37度复温45min）。具体条件还要摸索。二抗一般室温或37度30min-1h，浓度一般有工作液，若是浓缩液还要摸索浓度。

孵育时间过长非特异性条带显现的可能增加

一抗的孵育时间与温度、抗体浓度有关。一般情况下，在37℃的条件下，孵育1-2小时左右。在室温的条件下，孵育3小时左右。在4℃的条件下，孵育18-24小时左右。如果一抗的浓度过高或者是孵育时间过长，会导致非特异性吸附，增加洗涤的难度，最终因洗涤不彻底而出现非特性显色。