抗体孵育：一种抗体一个脾气

--WB真正的难点：抗体的使用是一种艺术，一种抗体一个脾气。

对WB结果有决定性影响的因素是抗体的效价和如果正确使用手中的抗体。无论你如何提高自己的转膜技术，高效和低效之间往往只有数倍的差异，而抗体的效价可以差数千倍以上；同样，正确使用抗体可以保证抗体效价不被过分的拮抗，谋求特异性和非特异性背景之间差异的最大化。

封闭最短可以缩减到5min：

很多人把高背景或者黑板，认定为封闭不充分，其实这也是没有吃透WB（说实话，经常看到坛子上很多人这样给人答疑，非常的无语）；实际上封闭（极端点）也是个可有可无的步骤，真正对降低背景起核心作用的是抗体稀释液中的组分。

当你的抗体使用次数较多时，基本不用封闭也可以有较低的背景；如果抗体很新，其实封闭最短可以缩减到5min（没试过更短的，不一定不可以）。那什么导致高背景甚至黑板呢？抗体的质量不太好（主因），或者抗体稀释液的配方有问题（增大抗体稀释比略微有所改善）。封闭液的配方可以和抗体稀释液相同，也可以不同；通常封闭液是最简单（单方）的抗体稀释液，而抗体稀释液可能是复方。

封闭很少出状况。不过在milk做封闭剂的封闭液中，milk颗粒未完全溶解时，微小的颗粒会粘附在膜上增加星点状背景。

紧接封闭操作的是抗体孵育，之间不要用TBST漂洗。抗体孵育成败的关键首要在抗体本身的质量，包括抗体的效价和背景的强弱。

抗体公司在出售抗体的时候，在广告上会玩很多花样。

A.不给整张膜标记的图示。很多抗体质量不好，背景高杂带多，如果靶蛋白区域较干净时，他们通常只给很窄的一条靶蛋白区域的图例

。B.不给内源性蛋白标记的图示，用IP的样品取代。通过IP可以富集抗原，减少杂蛋白，通常很容易拿到背景很干净，信号很强的图例。

C.用制备抗体时高表达的多肽做阳性样品，不给全长蛋白的图例。由于多肽可以IP富集，且不存在空间折叠的问题（通常裸露在外），因此很容易标记。除以上花样外，不少抗体用途上还有局限，因此挑选抗体时要睁大眼睛。

一抗通常4度过夜，效率较常温1-1.5hrs高；二抗通常1:5K稀释，室温0.5-1hr（过久并不会明显提高信号强度甚至会减弱（相当于洗膜），同时造成高背景进一步影响特异与非特异荧光信号强度间的对比。孵育时间过久还会迫使你延长TBST的时间，这对抗原识别能力较弱的抗体更致命）。洗膜通常用TBST，也可以考虑高盐洗膜液（NaCl 0.5M）；洗膜时间一般10miundefined3或者5miundefined4。抗体孵育和洗膜时，摇床速度不能过快也不宜过慢，需要简单摸索一下。

聊完以上那些浅显的基本常识，接下来谈我认为最麻烦的：

首先，抗原抗体识别原理的物理学解释，抗体孵育过程实际上就是一个竞争结合的动力学过程。由于抗原和抗体特异性结合的效率是非特异性结合的数百万--数十亿倍，所以当特异性抗体与非特异性‘抗体’（不好描述，指添加在抗体稀释液中的封闭蛋白，我们可以把它们看成非特异性的一抗）竞争时，尽管抗体稀释液中封闭蛋白的浓度是一抗浓度20K：1以上，在碰撞几率相同的条件下，由于时间的积累加孵育过程中反复漂洗（孵育抗体要摇晃，对吧），特异性一抗积累了识别、结合优势。同样在TBST等漂洗的情况下，由于亲和力等原因，使得一抗很牢靠并进一步增加对比优势，再经过2抗特异性积累和ECL的最终放大形成特异性条带和非特异性背景之间荧光信号的巨大差异。

由以上碰撞结合、亲和力差异这些基本现象，我们可以解释WB中出现的现象。

1.在样品制备章节中，我强调PBS漂洗去培养基中BSA的作用。当时只描述了不漂洗的后果，是在BSA位置任何抗体都可以非特异性的结合从而显影。用碰撞的原理去解释：当杂带很浓的时候，抗体的特异性已经毫无意义，它只符合物理定律中的碰撞几率原理；因为你的杂带浓，碰撞几率大，粘附一抗的机会多，因此它就会显出来，但切记这是杂带。当杂蛋白含量高到一定程度，“任何”一种一抗都可以在该位置显出条带。

因此，用条带的深浅去判断是否是靶蛋白，这是非常不科学的。在默认抗体有效的情况下，如果抗原靠近区域没有杂带，背景干净，依据分子量大小可以初步确认靶蛋白的位置；如果有杂带，并不一定是特异性条带就比杂带亮，也许杂带蛋白浓度大，非特异性粘附的一抗更多。

目前判断杂带和靶蛋白的唯一标准是分子量；而当分子量大小类似时，只有通过增加过表达或IP纯化的样品做阳性对照，或者KD该蛋白的样品做阴性对照一起电泳转膜，才能准确区分靶蛋白和杂质。（用IP或KD样品也是验证商品化抗体是否有效的可靠方案）

2.WB结果白板（无信号）和黑板（高背景）。从抗体孵育角度解释白板和黑板问题（当然也可能与ECL显影有关，此点下一节有阐述），白板主要是可能是抗体本身效价不高，或者抗体稀释液中封闭蛋白过多，竞争结合时封闭蛋白完全挤掉了特异性的一抗，特异性条带和非特异性背景同样结合强度--无信号。

黑板，也主要是因为抗体效价不高，而抗体稀释液中封闭蛋白的拮抗作用又没有完全发挥，此时无法有效识别抗原的一抗会等效的粘附转印膜的任何位置，显影后整张膜全黑。

有时候膜接近全黑，但可以若有如无的观察到靶蛋白，出现问题的原因虽然仍是抗体效价不高，封闭蛋白不能完全起到作用，不过此时可以通过改变抗体稀释液的配方，提高特异性和非特异性结合的信号差异，降低背景。

“这点非常重要”--当你的抗体标不到抗原时（白板），先弄出条带（黑板），再解决黑板（高背景）问题。第一步应该是通过倍比降低一抗的稀释比（从1:1K降到1:500到1:250到。。。；注：二抗稀释比不要轻易改变，增加二抗浓度对WB结果不会有太明显的改变），摸索到一个可以标出信号的条件。此时，由于一抗浓度过高，背景可能非常高，但背景的问题可以再调整，有没有特异性条带却没办法改变；实在没有靶蛋白的信号，只能更换别的公司生产的抗体。

那么如何通过改变抗体稀释液的配方，寻求抗体孵育的最佳条件呢？

首先要认清，抗体稀释液没有一个绝对通用的配方；一种抗体一个脾气。

其次，抗体稀释液的配方要兼顾与特异性抗体竞争抗原的强度，以及对其他区域的封闭强度两方面的平衡。

目前，抗体稀释液中可以充当封闭蛋白的主要有milk，BSA和gelatin，似乎很少的样子 。。。可是，你有没有考虑过“复方”？--这下配方无限多了吧。

1. 采用milk，BSA和gelatin的单方。3% milk，5% BSA，<=0.4%的gelatin，并根据实际情况改变（若出现白板，请降低封闭剂浓度。；黑板多加）。gelatin大家可能比较陌生，不过如果你翻翻抗体公司卖给你的原装抗体里面液体的配方，你会发现很多抗体溶液里都有它。

2.很多情况下单方的浓度很高了，背景问题仍不能解决。那么请尝试两两或者三种不同比例混合。不过有些细节还是要自己摸索的，比如gelatin＋BSA时，gelatin浓度不能无限提高（会完全竞争掉抗原抗体特异性结合，导致白板），BSA的浓度较随意。

3.抗体稀释液可用低盐浓度的TBST，也可用高盐浓度的缓冲液（NaCl 0.5M）以降低背景；但是切记，有的抗体对盐浓度敏感，包括构象和溶解度，因此需要尝试。

如果以上策略仍然无法解决高背景，可将稀释好的一抗先跟平时实验剪切下来的membrane的边角料（新的）放在一起孵育个把小时再用。如果还不行，彻底无解，结论抗体太差；请更换别的公司或者抗别的区段的同种抗体。

这三种封闭蛋白的差异：

milk和gelatin封闭效果不错且价格便宜，但milk容易发霉变质，且国产milk脱脂不充分亦增加背景、拮抗抗原抗体结合（拮抗与抗原结合尤其突出；更不知道三聚氰胺会不会影响抗原抗体结合或者ECL！？）；BSA封闭效果不佳，且价格较昂贵。个人推荐gelatin，gelatin主要成分是骨胶原，蛋白很大，但可以通过加热打断成小蛋白，从而实现封闭各种分子量大小的蛋白。

通常，我会将gelatin加到TBST中后直接灭菌，灭菌过程中，不溶的gelatin会逐渐溶解；由于gelatin可以灭菌（milk不可以），所以同样条件下，gelatin的存放时间明显长于milk。实际上，抗体可以反复用很久（通常一般的抗体常规稀释比，可以连续用一个月以上；对于老手用过2、3次的旧抗体更prefer，因此背景降到很低而效价正是最高的时候），通常抗体最后失效的原因不是因为使用次数过多，而是染菌；比较旧的抗体都会有很多的沉淀在底部，更长时间还会有异味。

稀释的一抗靠添加NaN3并于4度保存延长使用时间；二抗不能加NaN3，但放在-20度反复冻融延长使用寿命（抗体并非绝对不可以冻融；只是高浓度的原始管抗体的冻融对效价会有较大影响）。

抗体稀释液（一抗、二抗稀释液也可同也可不同）和封闭液可以相同，可以不同，因为抗体稀释液可以采用复方的，所以即使混合了少许，不会对抗体的使用产生较大的影响。不过封闭液用milk时，gelatin稀释的一抗混入少许milk会影响其使用寿命。

由于以上诸多可变因素，实在无法总结出一种万金油式的抗体稀释液（只能是多数通用），因此对待具体问题时，请具体对待