WB实战指南（五）之 难点：抗体孵育进阶篇

抗体孵育：进阶篇：

首先，抗原抗体识别原理的物理学解释，抗体孵育过程实际上就是一个竞争结合的动力学过程。由于抗原和抗体特异性结合的效率是非特异性结合的数百万--数十亿倍，所以当特异性抗体与非特异性'抗体'（不好描述，指添加在抗体稀释液中的封闭蛋白，我们可以把它们看成非特异性的一抗）竞争时，尽管抗体稀释液中封闭蛋白的浓度是一抗浓度20K：1以上，在碰撞几率相同的条件下，由于时间的积累加孵育过程中反复漂洗（孵育抗体要摇晃，对吧），特异性一抗积累了识别、结合优势。同样在TBST等漂洗的情况下，由于亲和力等原因，使得一抗很牢靠并进一步增加对比优势，再经过2抗特异性积累和ECL的最终放大形成特异性条带和非特异性背景之间荧光信号的巨大差异。

由以上碰撞结合、亲和力差异这些基本现象，我们可以解释WB中出现的现象。

1.在《WB实战指南（一）样品制备》文章中，我强调PBS漂洗去培养基中BSA的作用。当时只描述了不漂洗的后果，是在BSA位置任何抗体都可以非特异性的结合从而显影。用碰撞的原理去解释：当杂带很浓的时候，抗体的特异性已经毫无意义，它只符合物理定律中的碰撞几率原理；因为你的杂带浓，碰撞几率大，粘附一抗的机会多，因此它就会显出来，但切记这是杂带。当杂蛋白含量高到一定程度，“任何”一种一抗都可以在该位置显出条带。

因此，用条带的深浅去判断是否是靶蛋白，这是非常不科学的。在默认抗体有效的情况下，如果抗原靠近区域没有杂带，背景干净，依据分子量大小可以初步确认靶蛋白的位置；如果有杂带，并不一定是特异性条带就比杂带亮，也许杂带蛋白浓度大，非特异性粘附的一抗更多。目前判断杂带和靶蛋白的唯一标准是分子量；而当分子量大小类似时，只有通过增加过表达或IP纯化的样品做阳性对照，或者KD该蛋白的样品做阴性对照一起电泳转膜，才能准确区分靶蛋白和杂质。（用IP或KD样品也是验证商品化抗体是否有效的可靠方案）。

如何确定靶蛋白分子量？

由1中的解释可知，杂带比靶蛋白荧光信号强且干净一点也不意外，而经常不同的公司对同一靶蛋白给出不同的分子量，那么如何确定新上手不熟悉的靶蛋白的分子量呢？

A. 用“过表达或IP纯化的样品做阳性对照”，这是最靠谱的方案。

B. 没有纯化蛋白做对照时，对一个蛋白的分子量判断一般有这样几步：

a.根据氨基酸长度自己预测，如300aa，分子量应为33KDa；以这个分子量为基准进行第二步。

b.去抗体公司网站search说明书。一般先不要有偏向性，google abcam、Sigma，R&D以及millipore或者其他的scbt，benthyl等等等等吧，很快你至少可以发现3家是一致或接近的（诸如52KDa，有的写54KDa，有的51KDa，这些都可以算作一样，因为表观分子量也是对应marker的相对估算，会有一点点差异；尤其当不同公司给的marker在靶蛋白区域上下差别很大时，比如，你的蛋白100KDa，有的公司在此区间的marker是180KDa直接jump到80KDa，有的可能中间多一条120KDa，那么这两种marker估算的表观分子量可能差10KDa以上--尤其蛋白较大时，胶浓度又不低，分离会不太好，一些距离的细微差异，在软件估算表观分子量时偏差可能很大；其他蛋白这类问题不多，因为通常商品化的marker在120KDa以下指示条带较为密集，而且一般浓度的胶对这些区段分离都很好，所以估算的表观分子量差别不大，如上述52KDa例子），那么最终的表观分子量基本就是你检索到的。

如果和1中一致，那么完全不用怀疑；如果不一致，有条件再用纯化的含标签的蛋白做验证，没有基本也可以follow多数意见--必须指出，很多抗体公司在具体到每一种抗体的说明书时常见虚假广告的嫌疑，“恁把杂带当靶蛋白”（最搞的情况是同一公司同一靶蛋白，可能有用不同区段制备的靶蛋白的抗体，而这几种抗体识别的靶蛋白分子量还很不一致），所以请follow多数意见。

C. 蛋白一般只可能因为修饰向上迁移，所以表观分子量比根据氨基酸长度计算值高常见；反过来，如果表观分子量比计算值还低，多半就是杂带；除非你的蛋白会降解，或者有的蛋白在ORF里面还有一个翻译起始位点。

经验之谈，对于不熟悉的蛋白，通常都要小心求证，尤其在开始阶段；有条件的话，换个抗其他区段的同一蛋白的抗体或者其他来源（Rab、Gab、Mab）同一蛋白的抗体标记试试，两种抗体能识别同一杂带的概率还是很小的，尤其不同来源的，因为此时二抗也要相应更换，几率更小。

2.WB结果白板（无信号）和黑板（高背景）。从抗体孵育角度解释白板和黑板问题（当然也可能与ECL显影有关，此点下一节有阐述），白板主要是可能是抗体本身效价不高，或者抗体稀释液中封闭蛋白过多，竞争结合时封闭蛋白完全挤掉了特异性的一抗，特异性条带和非特异性背景同样结合强度--无信号。黑板，也主要是因为抗体效价不高，而抗体稀释液中封闭蛋白的拮抗作用又没有完全发挥，此时无法有效识别抗原的一抗会等效的粘附转印膜的任何位置，显影后整张膜全黑。

有时候膜接近全黑，但可以若有如无的观察到靶蛋白，出现问题的原因虽然仍是抗体效价不高，封闭蛋白不能完全起到作用，不过此时可以通过改变抗体稀释液的配方，提高特异性和非特异性结合的信号差异，降低背景。

“这点非常重要”--当你的抗体标不到抗原时（白板），先弄出条带（黑板），再解决黑板（高背景）问题。第一步应该是通过倍比降低一抗的稀释比（从1:1K降到1:500到1:250到。。。；注：二抗稀释比不要轻易改变，增加二抗浓度对WB结果不会有太明显的改变），摸索到一个可以标出信号的条件。此时，由于一抗浓度过高，背景可能非常高，但背景的问题可以再调整，有没有特异性条带却没办法改变；实在没有靶蛋白的信号，只能更换别的公司生产的抗体。