WB实战指南（四）之 难点：抗体孵育

抗体孵育——WB真正的难点：抗体的使用是一种艺术，一种抗体一个脾气。

对WB结果有决定性影响的因素是抗体的效价和如果正确使用手中的抗体。无论你如何提高自己的转膜技术，高效和低效之间往往只有数倍的差异，而抗体的效价可以差数千倍以上；同样，正确使用抗体可以保证抗体效价不被过分的拮抗，谋求特异性和非特异性背景之间差异的最大化。

封闭最短可以缩减到5min：

很多人把高背景或者黑板，认定为封闭不充分，其实这也是没有吃透WB（说实话，经常看到坛子上很多人这样给人答疑，非常的无语）；实际上封闭（极端点）也是个可有可无的步骤，真正对降低背景起核心作用的是抗体稀释液中的组分。当你的抗体使用次数较多时，基本不用封闭也可以有较低的背景；如果抗体很新，其实封闭最短可以缩减到5min（没试过更短的，不一定不可以）。那什么导致高背景甚至黑板呢？抗体的质量不太好（主因），或者抗体稀释液的配方有问题（增大抗体稀释比略微有所改善）。封闭液的配方可以和抗体稀释液相同，也可以不同；通常封闭液是最简单（单方）的抗体稀释液，而抗体稀释液可能是复方。

封闭很少出状况。不过在milk做封闭剂的封闭液中，milk颗粒未完全溶解时，微小的颗粒会粘附在膜上增加星点状背景。

紧接封闭操作的是抗体孵育，之间不要用TBST漂洗。抗体孵育成败的关键首要在抗体本身的质量，包括抗体的效价和背景的强弱，然而历来商品化的抗体质量参差不齐。各家生产的抗体中质量问题最严重的是scbt的抗体，但它们的价格却是最便宜的。其实，scbt在美国的售后服务还是相当不错的，只要按他们的要求操作仍然能举证抗体的质量问题，可以更换、交换（你指定的他们销售的另外一种抗体），有时候还会附送一些ProA beads之类的，所以不奇怪它的普及率；也正因为此，如果你参考文献的话很容易找到这家公司的。可惜，在国内代理商不可能提供相应的服务，因此购买他们的商品存在不小的风险。

所以，通常我更推荐sigma和Abcom、R&D等。诸如Sigma公司销售的Actin，cat. A5316，clone AC-74，Mab更是作为新手练习专用的抗体；它的背景很低，效价很高，可以1：30,000稀释（是普通一抗效价的30倍）。此外，尽管cell signaling是做磷酸化抗体起家的公司，但它们的抗体的质量总体感觉也不好，所以有其它公司可以选择时，我们会刻意避免购买cell signaling的产品，诸如Akt总抗和Ser473（这两种抗体R&D的产品效价不错）。

（特别注明：前几年CST的AKT抗体识别的条带在55KDa左右，而其他公司均认定为60KDa；最近还有战友提问这个抗体，重新检索了一下，应该是原AKT抗体（包括磷酸化）已经被CST自己下架了，从目前的几个抗体示意图看，大小也已与其他公司一致；因此，要不要买取决你自己）

抗体公司在出售抗体的时候，在广告上会玩很多花样。A.不给整张膜标记的图示。很多抗体质量不好，背景高杂带多，如果靶蛋白区域较干净时，他们通常只给很窄的一条靶蛋白区域的图例。B.不给内源性蛋白标记的图示，用IP的样品取代。通过IP可以富集抗原，减少杂蛋白，通常很容易拿到背景很干净，信号很强的图例。C.用制备抗体时高表达的多肽做阳性样品，不给全长蛋白的图例。由于多肽可以IP富集，且不存在空间折叠的问题（通常裸露在外），因此很容易标记。除以上花样外，不少抗体用途上还有局限，因此挑选抗体时要睁大眼睛。

此外，有一点值得注意的是，scbt销售的抗体表面上很多（通常1ml，而别的公司通常是200ul或者100ul），然而实际上它的浓度也仅为0.2耄允导噬纤强固宓闹柿恳埠推渌镜拿磺鸲际?200ug（常规）。所以在早期，我一直强调如果固定即用型一抗的浓度（稀释的一抗）为1ug/ml时，scbt的抗体最佳稀释比为1：200。不过近来发现，实际上他们的抗体1:2K稀释效价也不错，因此也许其他公司的一抗可以进一步提高稀释比。现在判断当时scbt抗体之所以采用1:200稀释，实际上是因为自制的ECL不够灵敏，所以建议用灵敏性更好的ECL，这样可以减少抗体的消耗量，进一步降低实验成本。

一抗通常4度过夜，效率较常温1-1.5hrs高；二抗通常1:5K稀释，室温0.5-1hr（过久并不会明显提高信号强度甚至会减弱（相当于洗膜），同时造成高背景进一步影响特异与非特异荧光信号强度间的对比。孵育时间过久还会迫使你延长TBST的时间，这对抗原识别能力较弱的抗体更致命）。洗膜通常用TBST，也可以考虑高盐洗膜液（NaCl 0.5M）；洗膜时间一般10miundefined3或者5miundefined4。抗体孵育和洗膜时，摇床速度不能过快也不宜过慢，需要简单摸索一下。