WB实战指南（八）之 Stirpping

Stirpping：

完整的WB流程结束后，可能需要重新标记某些膜，这时候就“可能”需要对膜stripping。这里用了“可能”二字，即不一定必须，那么首先讨论一下stripping的必要性。

Stripping排除其他的不讲，整个流程会耗费不少的时间，从节约时间的角度来讲能不做最好；并且stripping条件过于激烈或多轮洗脱时，还会剥离已转印到膜表面的抗原使WB的最终信号削弱；此外，stripping buffer未清除干净时，其中的某些组分一定会干扰第二种抗体的结合。那么在什么条件下不需要stripping呢？

1． 当A蛋白和B蛋白分子量差别5KDa以上（10KDa左右更保险），可将膜分割开（分别标记不同的抗体），这样就不需要stripping膜重新标记，且一次就能得到想要的结果。

有人会将两种抗体混在一起标记整张膜，这样操作的前提是非常熟悉这两种抗体的杂带位置，且各自的杂带都不会干扰目的蛋白才可以如此操作；并且这样的抗体下次使用有了局限性，因此不太推荐。

2． 两种抗体种属来源不同时，如鼠抗、兔抗等等，即使蛋白位置非常靠近无法切膜，这时候也不一定需要stripping。轮番标记这两种不同的抗体时，只需要用TBST涮掉表面的ECL，时间可长（一时腾不出手来就扔在那边一直漂，中间可以换换液）可短（换液涮两三次），然后直接用第二种抗体标记同一张膜。

不过，如果其中一种蛋白显影太强，隔天显第二种蛋白时可能会出现干扰（可能强可能弱）；但只要两个蛋白不是同样大小或者连在一起了，可以在最后作图时用PS切出来。

3． 当两种抗体种属来源相同时，有一种情况也不需stripping，诸如标记某蛋白的磷酸化和总蛋白时。由于磷酸化抗体通常识别能力较弱（相对于总蛋白而言），信号一般都不太强，此时也仅需简单的漂洗；但标记的顺序一定是先标磷酸化后标总蛋白。

以上避免stripping主要从节约时间的因素考虑，实际上当上述2、3点存在时，个人还是会用stripping buffer简单漂一下，然后用TBST换液漂洗3次再上第二种抗体；但如果时间较紧，就会真的省略。

Stripping膜至少有三种方法：

A．用TBST一直洗膜，洗8hrs以上就可以清除多数蛋白的信号，信号过强的蛋白如内参除外。所以，当你的抗体非常弱的时候，孵育过夜实际上相当于stripping，新的信号不会出现，原来的信号也会被漂洗干净，出现白板。

B．请参考millipore PVDF膜附送的说明书配方（没有，请Google），上面提到如果信号很强，可以在50度反应。需要提醒的是，由于巯基乙醇亦挥发，可以考虑临时添加。

C．如果做过IP，你就知道可以用低pH的Glycine-HCl洗脱beads上特异性吸附的蛋白。同理，0.1M Glycine（pH2.5,30min）也可以用于stripping膜，这是已知最廉价的高效洗膜方案。

而且经过TBST （10miundefined3）漂洗后，膜上的pH早就恢复到正常值，此时不存在上述stripping buffer残留成分干扰第二种抗体标记的情况。如果第一种蛋白信号过强，同样可以在50度stripping提高洗膜强度。

此外，膜风干后，表面结合的二抗也会脱落，不过不是很推荐。

看完stripping这个部分，再多想一层，你一定会找到同一张膜多次标记不同抗体的窍门。

如果有A、B、C三种蛋白，因分子量过于接近无法切膜：

a.如果A、B的抗体同是兔抗，C的抗体为鼠抗，则最合理的标记顺序为A-C-B或者B-C-A。

b.A、B、C的抗体同种来源，A、B几乎在一起，条带粘连；C靠下。如果A、B重要性差不多、B信号稍弱，则B-C-A；如果A的结果是最关键的，尽管B信号弱，一般还是A-C-B。

因为，经过两次stripping buffer洗脱，且两轮WB流程的时长都超过8hrs（一抗习惯4度过夜孵育），实际上在标记第三种抗体时，相对于经历了3次不同强度的stripping；不要担心第一种抗体还会有很强的干扰。