WB实战指南（三） 之 转印

转印——转印效率对WB结果的影响并不如书本和网络上宣扬的那么大！

首先必须澄清的是，很多时候新手会把WB结果无信号归咎于转膜不够充分，实际上转膜效率对最终结果的影响所占比重并不高，真正取决定性因素的是抗体识别能力的强弱，以及如何正确使用抗体，这个问题下节讨论。

有一个简单的例证，Biorad提供的3mm厚滤纸初次使用时，通常转膜效果不理想（从预染的marker深浅可知），但对多数一般丰度的蛋白的检测没有任何影响（建议少用这种新滤纸做那种含量特别稀少或者转膜非常困难的蛋白）。没有很好的策略可以解决这个新滤纸的问题；尝试过浸泡（会泡烂的）、预电泳（会稍微好点）等等，效果均不理想。通常，最初一两次的使用就是用于转一般蛋白。每次用完后清水稍微冲洗一下表面盐分（要控制水流；水流太大，纸张会烂掉的），晾干再用；只要没冲烂可以一直反复使用。

其次，尽管转膜效率不起决定性作用，但由于WB的流程相对较长，所以每个步骤的叠加作用会被级数放大，因此在试验的每个步骤我们仍会力求更好，因此以下仍会深入探讨如何提高转膜效率。

针对提高转膜的效率，个人认为最先应该考虑到的是仪器的选用。

这里不是歧视“made in China”，国内的厂家很少注重不断提高自己产品的品质，走低端策略，对于电泳仪这种技术含量不高的仪器倒可以凑合；但说到转膜仪，能把一个简单的匀场电极做好的还真不多（就我道听途说的，国外厂家为了使电极之间场强更加均匀，那种大块金属板表面是镀过极薄的白金层）；因此转膜效率和均匀方面孰优孰劣不言而喻。目前，个人使用过的国产电转槽（湿转）唯Tanon仿Biorad的还可以（算替它们免费打个广告吧，Tanon仿biorad mini3型电泳仪，在某些方面（主要是操作）上还优于Biorad原装；目前我认为“中国制造”的灵魂就是仿造并超越前者）；半干转仪一律进口，用过Biorad、amersham和英国公司的scie－plas。

PS：批评一下Biorad。Biorad的半干转仪，其硬质塑料外壳会莫名其妙的碎裂（绝非摔裂、磕碰，因为底面一般放在桌上后除定期需要清洗去除残留盐渍，基本不会移动；即便如此它自然就会碎裂），以致于其核心组件未坏的情况下，因外壳碎裂不得不报废该仪器（其外壳里包裹电源线，外壳碎裂，电源则无法接通，导致仪器报废——我们先后买过3台都是这样的毛病，其间间隔了3年，不能肯定近来Biorad有没有改进这个问题；如果没有，我想市场迟早会被其他公司所取代）

对这三款产品，Biorad的外壳有明显的质量缺陷，容易过早报废；amersham独特的蜂窝式设计确实对转膜效率有所提高，但蜂窝式使得与“三明治”的接触面减少，电转时散热不太好，做大蛋白（半干转仪也可以做大蛋白转膜，效率确实不如湿转，但抗体好、蛋白丰度一般时仍可采用）长时程（3hrs）转膜需要在4度冰柜或cold room进行；英国的产品，价格较高，公司不太出名国内不一定有代理，但质量和散热都非常好。

这里谈到了半干转和湿转。这两种转印方法各有优劣。湿转适合所有的蛋白，转膜效率最佳，但靡费试剂、溶液，对普通分子量大小的蛋白转染操作时间长于半干转（下文会具体给出条件）；半干转适合分子量较小的蛋白，省时、省试剂。蛋白分子大小如何界定呢？习惯上认为150KDa以上为大蛋白，其他均属于小蛋白，当然这只是一个相对标准。因此，通常对大蛋白的转印多数人会选择长时程的湿转，那么刚才提到的amersham半干转仪的缺陷实际上没太多实质意义，何况还可以外加条件弥补；而且用半干转做大蛋白转印本来就是高手在悬崖上跳舞，此时转膜效率是否更高已经没有任何意义——我说过转印效率对WB结果不起决定因素。

湿转、半干转缓冲液配方请参考分子克隆，有必要指出的是，实际上用半干转缓冲液进行湿转效果也非常理想，通常这种缓冲液可以反复使用多次（30V，～35V附近的时候，保险会自动跳掉、切断电转仪电源。至于UK的，即使整张大板胶室温电转3hr以后，最大电压仍为18V（因此足见其散热性能的优良）。

注明：以上半干转仪时间的要求是针对PVDF膜的，这里面有一个很有趣的问题。尽管厂家一再表明PVDF膜比NC膜对蛋白的截留更高（但NC带负电性，理论上它的吸附量应该更高，所以通常同样使用TBST这种低盐洗液背景比PVDF膜高），但PVDF膜对小分子的截留明显不如NC膜，因此交联在预染marker上的颜料小分子很容易穿过PVDF膜，造成转膜过度的假象（除可考虑提升甲醇浓度至25%外，也可以考虑增加marker的上样量）；NC膜没有这种问题，所以通常它的转膜时间也是小蛋白1hr、大蛋白3hrs，电流控制在200-300mA（16cundefined9cm大胶300mA，如果胶面积小很多可以考虑降低，实际上相当于2.5-3mA/cm2左右）。

NC膜唯一不如PVDF膜的地方，在我看来是它的强度：干燥的膜易碎。当然目前某些厂家为解决这个问题，将NC成分涂在另一种介质的表面，这种膜的支持强度和PVDF膜类似，但转膜效率稍差于纯NC膜，且有明显的正反面；因此制作转印三明治的时候要特别注意正反面。此外，20KDa以下的蛋白宜采用0.22uM孔径的转印膜，但也不是一定必须。

对于大蛋白转印，很多书本建议采用低浓度胶，如6% SDS-PAGE。但实际操作发现，6%太软，制作转印三明治的操作非常麻烦；且内参如Actin、tubulin都在45KDa附近，而6%胶底边溴酚蓝指示60KDa左右，除非采用坛子上有人提过的灌不同浓度的胶或者梯度胶，否则需要同时跑两块胶，因此也不是很推荐。个人经验认为300KDa以下8%胶（底边36KDa）都可以胜任，可以适当调整选择7-8%胶可以兼顾内参和大蛋白。

转膜最好在低温进行（高温会局部溶胶或降低转膜效率），尽管很多半干转仪没有具体要求，但用预冷过的电转液湿滤纸比未预冷的转印效率更高。因此，有条件建议湿转、半干转均在低温（4度）进行。此外，湿转缓冲液可以考虑转印前-20度预冷，时间不能长于2hrs，否则电泳液冻结；mini3型有内置冰槽的，冰槽置-80度预冷。

制作转膜三明治的过程中，书中强调过滤纸、胶、膜的大小最好一致，否则没有胶、膜隔开部分的滤纸会因为直接接触而产生局部短路，降低内阻增加电（压）流，造成升温过快。但进口仪器随厂原包装附带的滤纸有限，如果每次都切割新滤纸，消耗过快、初次使用的膜转膜效率不高，且增加额外的操作。因此，实际上滤纸大一些也不太要紧，但是我会选择已经切割好的和胶面积最接近的滤纸；通常膜的大小会严格控制在与胶面积一致或略小一点点。

操作时在保证每一层均无气泡的前提下，叠好后再碾压几个来回，力道要均匀、恰好；力量过大，胶会被拉伸，条带会扭曲、变形。碾压的目的不是为了驱赶气泡（完全可以做到叠加的时候每一层都无任何气泡；诸如采用多层薄滤纸时可以一张张的叠加），更重要的作用是让膜和胶贴得更紧密。可以理解的是，对于蛋白分子的大小而言，胶和膜之间的间距是数十万倍计的，因此更紧密的接触无疑是转膜成败的关键。

胶和膜需不需要泡呢？不少公司实验讲座时提出泡胶、泡膜，实际操作中没有发现泡和不泡的转膜效率有多大差别。实际上，胶只需要在电转液中浸一下即可（可以减少与滤纸或者膜之间的气泡）；而膜也只要湿掉沾上电转液即可，同样多沾些缓冲液会有利于减少气泡（PVDF要先用甲醇湿润再投入缓冲液；NC直接进缓冲液）。

如何监控转膜的效率呢？

在早期，鄙人亦依据分子克隆的介绍，采用立春红染膜。只是后来发现此操作不仅增加额外的操作时间，而且不能说明任何问题，于是抛弃之。首先，立春红（也包括考染胶）的灵敏度和HRP-ECL体系的灵敏度相差太远，即使立春红染膜无颜色，也无法提示WB结果会不会失败（考染胶无颜色也不能说明转膜充分了，除非你银染），你仍然得继续后面的操作；相反靶蛋白区域有颜色，亦无法提示靶蛋白就转膜完全了，也许只是另外一个分子量大小相近的蛋白。

因此，无论立春红染膜失败或成功，你都必须进行后续的操作。而立春红染胶不仅增加额外的操作时间，而且增加一轮漂洗的操作，对膜和膜上的蛋白都不好。那么为什么不采用更直观的预染marker做转膜监控的依据呢？理论上，同时转膜、颜色是交联到蛋白上的，因此颜色有多深表明有多少蛋白转印到膜上，非常直观、不会增加任何额外的操作（固定marker的上样量非常必要）。当然上面提到针对PVDF膜，由于对小分子截留的局限，颜料分子会在高强度的转印过程中从交联的蛋白上脱落并穿过膜（颜料与蛋白交联得过深会使整个lane糊掉；太紧（多）可改变蛋白构象使迁移率改变。

所以多数情况下颜料和蛋白之间是一种不稳定的交联，这意味着在某些条件下，颜料会从交联的蛋白上脱落，又因为膜分子孔径以及膜对不同物质吸附能力的差异，颜料小分子会轻易穿过膜到滤纸背面，而蛋白则被牢固的截留在膜上），造成转膜过度的假象。现在你知道有这种局限，要么更换NC膜；要么采用上面提到的非常稳定的转膜条件、注意必要的细节，就可从根本上忽略掉其对转膜效率的指示，而把预染的marker仅仅作为一个分子量大小的指针，当然同时可确认之前的转膜操作无误（没有插反电极，放反膜），也可为后续抗体孵育操作时膜的正反面做必要的提示。

不同公司预染的marker效果不太相同，一般NEB和invitrogen的常规分子量预染marker要上8-10ul，MBI的只要5ul（胶大小20×30cm），Biorad－mini3型（8.2×7.4cm)MBI最低2.5ul转膜后就足够清晰。