三、用 PCR 扩增目的 cDNA 片段

PCR（polymerase chain reaction）作为一种常用的分子生物学实验手段，已非常成熟。各个公司推出了各种高保真和高效率的聚合酶及成套的 PCR 试剂盒，使得 PCR 技术简便而且有效。

1. 方法的选择：对于两端序列已知的情况，可根据两端序列设计引物，选用普通的 PCR 方法。对于只知道一端序列的情况，可使用（rapidly amplication cDNA ends）技术，RACE 分为 3' 和 5' 两种（Gibco 公司），也有两端 N 时逬行扩增的 RACE（Clontech 公司）。

2. PCR 扩增的模板：PCR 扩增的模板通常是指由 mRNA 逆转录而来 cDNA 第一链。PCR 模板量的多少直接影响到扩增的结果。在逆转录过程中，通常会加入一些接头（univursaladaptor）， 以便进行 PCR 的单引物扩增（锚定 PCR）。

3. PCR 扩增的特异性：决定 PCR 扩增特异性的因素很多，但通常有以下几点：

3.1 一股认为 PCR 反应所需的 mRNA 模板以仅为 1 ug。增加模板量可以提高扩增效率，但同时也使非特异产物增加。

3.2 PCR 中所使用的 Taq 酶通常有错配现象，出现频率约为 0.2％～0.5％。所以可以使用一些具有3'-5' 外切酶活性的高保真聚合酶，如 Pfu 酶、Vent 酶（Biolab）及 Pyrobcst 酶（Takara）等。

3.3 通常认为增加退火温度及减低 Mg^2＋浓度可以提高扩增的特异性。

3.4 在 PCR 体系的操作中，将模板最后加入体系中及热启动等方法可以提高扩增的特异性。

4. 扩增产物：对产物可以采用酶切或 Northen 和 Dot 的杂交鉴定，并结合扩增片段的大小来确定是否为目的 cDNA。