PCR扩增分离目的DNA片段

一、目的
了解多聚合酶链反应DNA 扩增技术的基本原理和实验应用，掌握PCR反应基本技术。
二、原理
PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应是1986 年由Kallis Mullis 发现。这项技术已广泛地应用于分子生物学各个领域，它不仅可用于基因分离克隆和核酸序列分析，还可用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病诊断，肿瘤机制探查，法医鉴定等方面。PCR技术已成为方法学上的一次革命，它必将大大推动分子生物学各学科的研究发展。
PCR是一种利用两种与相反链杂交并附着于靶DNA两侧的寡核苷酸引物经酶促合成特异的DNA 片段的体外方法，由高温变性，低温退火和适温延伸等几步反应组成一个循环，然后反复进行，使目的的DNA 得以迅速扩增，主要过程如图6。置待扩增DNA 于高温下解链成为单链DNA 模板；人工合成的两个寡核苷酸引物在低温条件下分别与目的片段两侧的两条链互补结合；DNA聚合酶在72℃将单核苷酸从引物3'端开始掺入，沿模板5'―3'方向延伸，合成DNA 新链。由于每一循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，所以PCR 产物以指数方式增加，经25―30次周期之后，理论上可增加10⁹ 倍，实际上可增加10⁷ 倍。
PCR 技术具有操作简便、省时、灵敏度高特异性强和对原始材料质量要求低等优点，但由于所用的TaqDNA 聚合酶缺乏5'―3'核酶外切酶活性，不能纠正反应中发生的错误核苷酸掺入，估计每9000个核苷酸会导致一个掺入错误，不过Innis M・A 发现，错误掺入的碱基有终止链延伸的作用倾向，使得错误不会扩大。

图3－4 PCR 原理示意图
PCR 技术应用广泛，不可能有这样一套条件满足所有的实验，但本实验所介绍的方法可适应于大多数DNA 扩增反应，即使有的不适应，至少也确定了一个共同的起点，在此基础上可以作多种变化。不过下列因素在实验应用时应予以特别注意，以求取得满意结果。
1、模板：单、双链DNA 和RNA都可以作为PCR样品，若起始材料是RNA，须先通过逆转录得取第一条cDNA。虽然PCR 可以仅用极微量的样品，但为了保证反应的特异性，一般宜用ng 量级的克隆DNA，ug 级的染色体DNA，待扩增样品质量要求较低，但不能混合有任何蛋白酶、核酸酶，Taq DNA聚合酶的抑制剂以及能结合DNA 的蛋白质。
2、引物：引物是决定PCR 结果的关键，下列原则有助于引物的合理设计。（1）尽可能选择碱基随机分布，GC 含量类似于被扩增片段的引物，尽量避免具有多聚嘌呤、多聚嘧啶或其它异常序列的引物。（2 ）避免具有明显二级结构（尤其是在引物3'―末端）的序列。
（3 ）防止引物间的互补，特别要注意避免具有3'末端重叠的序列。
（4）引物的长度约为20个碱
基，较长引物较好，但成本增加，短引物则特异性降低。
（5）引物浓度不宜偏高，过高易形

三、材料
（一）仪器与器皿
PRC 扩增仪（PE2400），琼脂糖凝胶电泳设备，微量取样器，一次性指形管，凝胶成像仪 玻片
（二）试剂与材料
1．琼脂糖凝胶电泳试剂
1）电泳缓冲液：Tris―乙酸0.04mol/L PH8.0 0.002mol/L EDTA
2）加样缓冲液：0.25%溴酚兰40% w/v蔗糖
3）溴化乙锭溶液：0.05mg/ml溴化乙锭/水
4）琼脂糖
2．TaqDNA 多聚酶
3．5´反应缓冲液：
125mmol/L Tris-HCl pH8.2；10mmol/L MgCl2；0.5mg/ml gelatin；125mmol/L(NH4)2SO4； Formamide 25%
4．混合dNTP 液(dATP dGTP dTTP dCTP各2mmol/L)
5．DNA 模板（每2´ ml 中含有10fg 待扩增DNA）
6．引物 1 （25pmol/L），5’加入EcoRI 粘性末端碱基
7. 引物 2 （25pmol/L），5’加入HindIII 粘性末端碱基
8.无菌水
四．实验步骤
1.按顺序在200ml 指形管中加入以下试剂与样品：（因购入的试剂批次不同，加样时有
所差别，以预实验结果为准。）
1） ddH₂ O 74ml
2） 10´Buffer 10ml
3） MgCl₂ 6ml（10´Buffer 如已加入MgCl2，则不必加）
4） dNTP 2ml
5） 引物1 2ml
6） 引物2 2ml
7） 模板 2ml
8） TaqDNA聚合酶2ml
总体积共100ml（也可以配成40ml 的反应体系）
2.在PCR 扩增仪上按以下反应条件编入程序：（以下为参考值，因扩增的DNA片段不同，
各类PCR 扩增仪程序设定各不相同，编程过程视扩增的DNA 片段的要求及仪器而定参数，见
示范。）
1．预变性 94℃ 2 分种
2．循环条件（30 次）
变性 94℃ 40 秒
复性 55℃ 35 秒
延伸 72℃ 2 分10 秒
3．延长延伸 72℃ 7 分钟
编完反应程序，置反应管于PCR扩增仪的反应孔中，开动机器，扩增循环反应开始。
3.PCR 扩增完毕，配2%琼脂糖凝胶，取15ml 反应液及相适应的PCR mark 分别点样，
加样缓冲液应为40%W/V 蔗糖，电泳观察结果。
4.凝胶成像仪或紫外灯下观察实验结果，是否已扩增到实验设计的DNA 片段。