原理
大多MDR细胞膜上出现MDR-1基因及其基因产物P-糖蛋白过度表达。 多药抗药基因的表达实验是通过反转录和PCR的方法来检测这些特定基因的过度表达。
材料与仪器
RNA
PBS 氯仿 异丙醇 萘酸 异硫氰酸肽 十二烷基肌酸钠 构橼酸钠 乙酸钠 二疏基乙醇 乙醇 Taq酶
离心机 紫外分光光度计 琼脂糖凝胶电泳 PCR仪
PBS 氯仿 异丙醇 萘酸 异硫氰酸肽 十二烷基肌酸钠 构橼酸钠 乙酸钠 二疏基乙醇 乙醇 Taq酶
离心机 紫外分光光度计 琼脂糖凝胶电泳 PCR仪
步骤
一、细胞总RNA提取
1. 收集约5x107个细胞，冷PBS洗涤。
2. 加入400 ul RNA提取液（含6 mol/l 的异硫氰酸肽，0.5%十二烷基肌酸钠，0.025 mol/l 构橼酸钠pH7.0，0.25 mol/l 乙酸钠，pH4.0，0.5%二疏基乙醇，50%萘酸），混匀。
3. 加入400 ul 氯仿，混匀，以13 000 r/min 于4℃离心15 min。
4. 取上清液加入等体积的异丙醇，4℃放置30 min。
5. 然后以13 000 r/min 离心15 min，吸上清，将RNA成点用75%的乙醇洗涤1次，溶于100 ul 的无菌双蒸馏水中。
6. 并用紫外分光光度计检测RNA纯度（A260/A280应为1.8~2.0）后备用。
二、反转录及PCR扩增
1. 引物
2. 取细胞总RNA10 ul 加入20 ul AMV逆转录酶反应体系中，42℃保温30 min 进行反转录，合成cDNA。
3. 然后置95℃，3 min 终止反转录。
4. 接着在Taq酶的作用下，用mdr-1和β2-MG引物，对cDNA上的目的片段进行PCR
5. 94℃预变性2 min，然后94℃变性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸1 min，扩增35个循环。
6. 最终在60℃保温7 min，以保证产物充分延伸。
7. 取10 ul 扩增产物在3%琼脂糖凝胶电泳后，紫外灯下照相，与mdr-1 cDNA阳性对照，等位的DNA条带为阳性，反之为阴性。
注意事项
1. 尽可能在低温下操作；
2. 适量斟酌Trizon等的用量；
3. 在每一次离心后除尽蛋白质、不溶物
提取操作时必须戴手套、口罩等防止DNA酶的影响；
4. 注意Trizon带有腐蚀性；
5. 最重要的就是防止DNase的污染，手套、口罩必不可少，所用的枪头和EP管等也要RNA提取专用的，无DNA酶的。
来源：丁香实验
