PCR扩增DNA

【实验目的】
1.掌握PCR扩增DNA的技术及原理
2.学习PCR扩增仪的使用

【实验原理】
聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是一种体外DNA扩增技术，1985年由Mullis等人创立。该技术能在几小时的实验操作中，将人为选定的一段DNA扩增几百万倍，具有灵敏度高、特异性强、操作简便和应用广泛等优点，目前已成为分子生物学及基因工程中极为有用的研究手段，另外在医学研究和医疗诊断中亦体现出极大的应用价值。

PCR的工作原理类似于DNA的体内复制过程，是将待扩增的DNA片断和与其两侧互补的寡核苷酸链引物经变性、退火及延伸三步反应的多次循环，使特定的DNA片断在数量上呈指数增加。PCR扩增首先需要一对引物，根据待扩增区域两侧的已知序列合成两个与模板DNA互补的寡核苷酸作为引物，引物序列将决定扩增片段的特异性和片段长度。反应体系由模板DNA、一对引物、dNTP、耐高温的DNA聚合酶、酶反应缓冲体系及必须的离子等所组成。

PCR反应循环的第一步为加热变性，使双链模板DNA变性为单链；第二步为复性，每个引物将与互补的DNA序列杂交；第三步为延伸，在耐高温的DNA聚合酶作用下，以变性的单链DNA为模板，从引物3ˊ端开始按5ˊ→3ˊ方向合成DNA链。这样经过一个周期的变性——复性——延伸等三步反应就可以产生倍增的DNA，假设PCR的效率为100%,反复n周期后，理论上就能扩增2n倍。PCR反应一般30-40次循环，DNA片段可放大数百万倍。

常规PCR反应用于已知DNA序列的扩增，变性温度为95℃，复性温度为37℃～55℃，延伸合成温度为72℃，DNA聚合酶为Taq酶（可耐受95℃左右的高温而不失活），反应循环数为30。

【实验材料】
1.实验器材
PCR扩增仪，台式高速离心机，移液器，经高压灭菌后的Eppendorf管，电泳仪。

2.实验 试剂
（1）模板DNA（0.1µg/µl）：用牙签挑取单菌落悬浮到50µl的裂解液中（裂解液1%TritonX-100，20mmol/l Tris-HCl PH 8.2, 2mmol/l EDTA）, 95℃温浴10分钟, 10000rpm离心5分钟,取2µl上清液用于总体积50µl的PCR反应。
（2）TaqDNA聚合酶（5U/µl），10×扩增缓冲液，dNTP（1mmol/L）：购买
（3）引物（100pmol/L）：设计并合成与目的DNA两侧互补的引物内。

【实验操作】
1．准备PCR反应溶液
（1） 按以下次序，将下列成分在0.5ml灭菌Eppendorf管内混合：
10×扩增缓冲液 10µl
4×dNTPs(包括四种dNTP) 8µl
引物1 1µl
引物2 1µl
模板DNA 1µl (10ng)
Taq DNA聚合酶 1µl (2.5U)
加水至终体积 100µl
（2） 用手指轻弹Eppendorf管底部，使溶液混匀。在台式 离心机 中离心2秒以集中溶液于管底。
（3）加石蜡油50µl封住溶液表面。