材料与仪器
从兴趣基因 PCR 扩增获得的 DNA
10 X T4 多聚核苷酸激酶缓冲液 ASO 工作液 T4 多聚核苷酸激酶 2 X SSC 变性溶液 TMAC 杂交溶液 TMAC 洗脱液
恒温槽 斑点-印迹设备 尼龙膜 Whatman 3MM 滤纸 真空烤炉 可封口袋 振荡水浴或杂交炉 Kodak Biomax MS 胶片 X 线片盒和增光屏
10 X T4 多聚核苷酸激酶缓冲液 ASO 工作液 T4 多聚核苷酸激酶 2 X SSC 变性溶液 TMAC 杂交溶液 TMAC 洗脱液
恒温槽 斑点-印迹设备 尼龙膜 Whatman 3MM 滤纸 真空烤炉 可封口袋 振荡水浴或杂交炉 Kodak Biomax MS 胶片 X 线片盒和增光屏
步骤
![用32P 标记个体ASO la. 对于每个待标A S 0 , 准备下列标记反应： 0. 75jul H 2 O ; 1. OOjjJ 1 0 X T 4 多聚核苷酸激酶缓冲液； 5. OOjul Zpmol/L A S O 工作液； 3. OOmI10mCi/ml [y-32P] A T P ； 0. 25jul lOU/^1 T 4 多聚核苷酸激酶； 37°C 恒温槽孵育lh。 2a. 加 90^1水，混勻，稍做离心并收集试管底部溶液，马上使用或一20°C 保存。 32P 标 记ASO探针池 lb. 对于每个A S O 探针池，须确定探针池中A S O 的总皮摩数。注意探针池中A S O 的 总皮摩数对10mCi/ml [7-32P] A T P 的体积比值应为3. 3。调整第Ia步中总反应及 各反应组分的体积以保证该比值。 37°C 恒温槽孵育lh。 2b. 加 4 倍体积的水，混勻，稍做离心并收集试管底部溶液，马上使用或一20°C 保存。 3. 按制造商要求准备点杂交设备，如有必要，清洗相关设备。 4. 剪一块与点杂交设备大小相适应的尼龙膜。在干胶上做不对称标记以便于杂交后确 定方向。 5. 将膜漂浮于水面使其湿润（ 膜应该立即湿润） ，然后浸没直至使用，以 2X S S C 溶液 部分充填一容器。 6.对于每个要杂交到膜上的样品，加 92jul变性液至8jlJ 兴趣基因的P C R 扩增产物（ 最 多 11种不同产物）或多重P C R 产 物 （ 每一产物200ng) 中。振荡混匀。同时准备阳 性对照、阴性对照及P C R 反应对照（ 即不含模板D N A )。 7. 放膜在点杂交仪垫板上，安装斑点杂交板。在载样前不要使用真空抽吸。 8. 当所有的样品都与变性液混匀后，对点杂交设备进行真空抽吸。所有样品全部加入 到对应的孔，避免膜上产生气泡。小心不要触摸或戳破过滤器。 9•在真空抽吸状态下，拿开点杂交设备的上层封盖，快速拿开杂交膜，并将膜上多余](http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2016/08/B1470020805807pe7u6bqmbxpng_small.jpg)
来源：丁香实验
