原理
以DNA为模板,在4种核苷酸存在的条件下,借助DNA聚合酶作用出现的酶促合成,依赖于在加热条件下,双链DNA解离成单链(变性),降温(复性),使引物与单链特异性结合,同时使4种核苷酸在DNA聚合酶的作用下,发生以引物为起点进行聚合的现象,使DNA链不断延伸,PCR反应进行。反应步骤包括:变性(常规采用94℃高温条件下使待扩增的模板DNA氢键断裂,解链成为单链模板)、退火(人工合成的引物在低温下分别与模板DNA单链形成杂交链)、延伸(在72 ℃条件下,DNA聚合酶将单核苷酸在引物3'端掺入,延模板3'→5'方向延伸,合成新的DNA链)。以上三步反应构成一个周期,每一周期产生的DNA均可成为下一个循环的模板,PCR产物以指数方式增加。
材料与仪器
质粒
Taq DNA 聚合酶 引物 dNTP混合物 PCR Buffer
PCR 扩增仪
Taq DNA 聚合酶 引物 dNTP混合物 PCR Buffer
PCR 扩增仪
步骤
1. 按下列组分配制PCR 反应液:
![](http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2014/02/B1393309309_small.jpg)
共50 μl
2. PCR 反应条件
95 ℃ 5 min
95 ℃ 30 sec
55 ℃ 30 sec 30 Cycles
72 ℃ 1 min
72 ℃ 10 min
4 ℃ forever
3. 琼脂糖凝胶电泳检测结果
注意事项
PCR 反应液在冰中配制,然后置于PCR 反应仪上进行PCR反应, 这样可增强PCR扩增的特异性, 减少PCR过程中的非特异性反应, 能得到良好的PCR 结果。
来源:丁香实验