原理
在设计引物时,一对引物两端分别加了两个酶切位点,这两个酶切位点与pEGFP-C1 载体多克隆位点中的酶切位点相吻合,且位置和方向都合适。这样, 目的基因片段和pEGFP-C1 载体经双酶切后,由于酶切位点一致,在T4 DNA 连接酶的作用下就可以连接。
材料与仪器
DNA 片段
pEGFP-C1 载体 限制性核酸内切酶 Ligation Buffer T4 DNA Ligase
冰盒
pEGFP-C1 载体 限制性核酸内切酶 Ligation Buffer T4 DNA Ligase
冰盒
步骤
1. 双酶切纯化的目的DNA 片段和pEGFP-C1 载体。
反应体系：
反应条件： 37 ℃ 2 hrs 至过夜
2． 回收后电泳检测浓度， 然后进行连接反应。
反应体系：
反应条件： 室温2 hrs， 或者4 ℃过夜。
注意事项
10 ×Ligation Buffer 用之前要震荡混匀。
来源：丁香实验
