🔥 质粒提取

1、挑取含有目的 DNA 重组体的单个菌落接种在 3 ml LB（含有 Amp 或 Kan）液体培养基中，37 ℃，225 rpm 培养 12~16 h。

2、提取质粒 

（1）离心菌液，废弃上清。 

（2）加入 250 μl Buffer P1，使菌片重悬，务必使片状物不可见。

（3）加入 250 μl Buffer P2，上下颠倒 EP 管 4~6 次，操作时间要少于 5 min。

（4）加入 350 μl Buffer N3，上下颠倒 EP 管 4~6 次，可见絮状沉淀。

（5）离心 13000 rpm，10 min。 

（6）离心后的上清液移入收集管（放有吸附柱）中。

（7）13000 rpm 离心 30~60 s，弃滤液。 

（8）加入 0.5 ml Buffer PB，13000 rpm 离心 30~60 s，弃滤液。

（9）加入0.75 ml Buffer PE，13000 rpm 离心 30~60 s，弃滤液。

（10）13000 rpm 再离心 1 min，弃滤液。 

（11）将吸附柱移到新的 1.5 ml EP 管上。 

（12）加 50 μl Buffer EB 至滤膜中央，室温静置 1 min，13000 rpm 离心 1 min。即获得所需质粒。

3、酶切鉴定。

反应体系：20 μl 体系；反应条件：37 ℃ 2~3 h。

 

 

4、电泳：观察酶切结果。