材料与仪器
质粒提取试剂盒 限制性核酸内切酶
离心机 振荡培养箱 电泳装置 冰盒 恒温水浴箱
离心机 振荡培养箱 电泳装置 冰盒 恒温水浴箱
步骤
1. 挑取含有目的DNA重组体的单个菌落接种在3 ml LB（含有Amp或Kan）液体培养基中，37 ℃，225 rpm培养12～16 hrs。
2. 提取质粒
⑴离心菌液，废弃上清。
⑵加入250 ul Buffer P1，使菌片重悬，务必使片状物不可见。
⑶加入250 ul Buffer P2，上下颠倒EP管4～6次，操作时间要少于5 min。
⑷加入350 ul BufferN3，上下颠倒EP管4～6次，可见絮状沉淀。
⑸离心13000 rpm，10 min。
⑹离心后的上清液移入PrepSpinColumn。
⑺13000 rpm离心30～60Secs，弃滤液。
⑻加入0.5 mlBufferPB，13000 rpm离心30～60 Secs，弃滤液。
⑼加入0.75 mlBufferPE，13000 rpm离心30～60 Secs，弃滤液。
⑽13000 rpm再离心1 min，弃滤液。
⑾将PrepSpinColumn加到新的1.5 mlEP管上。
⑿加50 ul BufferEB至滤膜中央，室温静置1 min，13000 rpm离心1 min。即获得所需质粒。
3. 酶切鉴定
反应体系（20 ul 体系）：
反应条件：37 ℃ 2-3 hrs
4. 电泳：观察酶切结果。
来源：丁香实验
