含有目的基因真核表达 pEGFP-C1 载体的构建实验

细胞实验

最新修订时间：2022-05-13

简介

本实验是以DNA为模板，在4种核苷酸存在的条件下，借助DNA聚合酶作用出现的酶促合成，依赖于在加热条件下，双链DNA解离成单链（变性），降温（复性），使引物与单链特异性结合，同时使4种核苷酸在DNA聚合酶的作用下，发生以引物为起点进行聚合的现象，使DNA链不断延伸，PCR反应进行。内容来源：中国医科大学实验指导手册。

来源：丁香实验

操作方法

含有目的基因真核表达 pEGFP-C1载体的构建实验

1PCR扩增2克隆3转化4质粒提取

克隆法（含有目的基因真核表达pEGFP-C1载体的构建实验）

1. 双酶切纯化的目的DNA 片段和pEGFP-C1 载体。反应体系：反应条件： 37 ℃ 2 hrs 至过夜 2．回收后电泳检测浓度，然后进行连接反应。反应体系：反应条件：室温2 hrs，或者4 ℃过夜。

转化

1. 100 ul感受态细胞在冰中融化。 2. 分装2管，50 ul/管。 3. 加入转化的DNA Xul。 4. 冰中放置30 min。 5. 42 ℃放置90 sec。 6. 冰中放置2～3 min。 7. 加入4倍体积的SOC液体培养基或LB液体培养基。 8. 37 ℃振荡培养1 hrs。

🔥 质粒提取

1、挑取含有目的 DNA 重组体的单个菌落接种在 3 ml LB（含有 Amp 或 Kan）液体培养基中，37 ℃，225 rpm 培养 12~16 h。2、提取质粒（1）离心菌液，废弃上清。（2）加入 250 μl Buffer P1，使菌片重悬，务必使片状物不可见。（3）加入 250 μl Buffer P2，上下颠倒 EP 管 4~6 次，操作时间要少于 5 min。（4）加入 350 μl