含有目的基因真核表达 pEGFP-C1 载体的构建实验
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简介
本实验是以DNA为模板，在4种核苷酸存在的条件下，借助DNA聚合酶作用出现的酶促合成，依赖于在加热条件下，双链DNA解离成单链（变性），降温（复性），使引物与单链特异性结合，同时使4种核苷酸在DNA聚合酶的作用下，发生以引物为起点进行聚合的现象，使DNA链不断延伸，PCR反应进行。内容来源：中国医科大学实验指导手册。
来源：丁香实验
操作方法
1PCR扩增2克隆3转化4质粒提取
PCR扩增法1. 按下列组分配制PCR 反应液： 共50 μl 2. PCR 反应条件 95 ℃ 5 min 95 ℃ 30 sec 55 ℃ 30 sec 30 Cycles 72 ℃ 1 min 72 ℃ 10 min
克隆法1. 双酶切纯化的目的DNA 片段和pEGFP-C1 载体。 反应体系： 反应条件： 37 ℃ 2 hrs 至过夜 2． 回收后电泳检测浓度， 然后进行连接反应。 反应体系： 反应条件： 室温2 hrs， 或者4 ℃过夜。
转化1. 100 ul感受态细胞在冰中融化。 2. 分装2管，50 ul/管。 3. 加入转化的DNA Xul。 4. 冰中放置30 min。 5. 42 ℃放置90 sec。 6. 冰中放置2～3 min。 7. 加入4倍体积的SOC液体培养基或LB液体培养基。 8. 37 ℃振荡培养1 hrs。 9. 涂平板，37
质粒提取1. 挑取含有目的DNA重组体的单个菌落接种在3 ml LB（含有Amp或Kan）液体培养基中，37 ℃，225 rpm培养12～16 hrs。 2. 提取质粒 ⑴离心菌液，废弃上清。 ⑵加入250 ul Buffer P1，使菌片重悬，务必使片状物不可见。 ⑶加入250 ul Buffer P2，上下颠倒EP管4～6次，操作时间要少于5 min。
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