目的DNA片段的分离、回收

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【实验原理】
琼脂 糖凝胶电泳与醋酸纤维素薄膜电泳原理基本相同，但兼有分子筛效应，从而使不同分子量大小的DNA片段分离。琼脂糖是从琼脂中提取出来的含有较多的酸根和羟基多糖。回收DNA的方法很多，主要包括DEAE纤维素纸插片电泳法、透析袋电泳洗脱法、槽沟电泳洗脱法、v形槽电泳洗脱法以及低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法。本实验采用琼脂糖凝胶DNA片段纯化试剂盒，此试剂盒采用独特的凝胶融解系统，结合DNA制备膜技术，具有高效、快速、方便之特点，全套操作只需要30分钟便可完成。使用此试剂盒每次可纯化得到多至10μg 的DNA片段（100bp -30kb ）,回收率高达50-80%。
【器材】
1．紫外分光仪
2．离心机
【试剂】
1．琼脂 糖凝胶
2．DNA Purification Kit（Takara ）
【操作步骤】
1．使用TAE缓冲液制作琼脂 糖凝胶，然后对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳。
2．在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂 糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体。
3．切碎胶块。
4．称量胶块重量，计算胶块体积（1mg =1μl）。
5．向胶块中加入胶块融化液DR-I Buffer, DR-I Buffer 的加量如下表：

 

凝胶浓度

DR-I Buffer 使用量

1.0%

3个凝胶体积量

1.0-1.5%

4个凝胶体积量

1.5-2.0%

5个凝胶体积量

6．均匀混合后75℃加热融化胶块（低溶点琼脂糖凝胶只需在45℃加热）。振荡混合，使胶块充分融化（约6-10min）。
7．向上述胶块融化液中加入DR-I Buffer 量的1/2体积量的DR-II Buffer，均匀混合。当分离小于400bp的 DNA片段时，应在此溶液中再加入终浓度为20%的异丙醇。
8．将试剂盒中的Spin Column 安置于Collection Tube上。
9．将上述操作7的溶液转移至Spin Column中，3600rpm 离心1min。
10．将500μl 的Rinse A 加入Spin Column中，3600rpm 离心30Sec，弃滤液。
11．将700μl的Rinse B加入Spin Colum中，Spin Colum中，离心30Sec ，弃滤液。
12．重复操作步骤11，然后12 000 rpm再离心1min。
13．将Spin Column按置于1.5ml 的离心管上,在Spin Column膜的中央处加入25μl的水或洗脱液,室温静置1min。
14．12 000 rpm离心1min 洗脱DNA。