脉冲场凝胶中DNA片段的直接回收
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原理
低熔点琼脂糖制备规模的 PFGE 经常被用于 DNA 片段的分离。不同大小的 DNA 可以用限制酶酶切产生高分辨率酶切图谱或产生用于插入噬菌体或质粒载体的片段。
材料与仪器
DNA 大小标准 基因组 DNA
溴化乙锭 酚：氯仿
水浴
溴化乙锭 酚：氯仿
水浴
步骤
一、材料
1. 缓冲液和溶液
溴化乙锭 ( 1 μg/ml ) 或适当稀释度的 SYBR Gold
酚：氯仿（1:1, V/V) ( 可任意选择的）
2. 核酸和寡核苷酸
DNA 大小标准
低熔点琼脂糖栓包埋的基因组 DNA
3. 专用设备
设置 65~68℃ 及琼脂糖酶消化的适宜温度的水浴
二、方法
1. 准备制备用低熔点琼脂糖 PFGE, 它将提供分离目的 DNA 片段的最佳分辨率。
2. 制备槽的两侧加样孔分别加入 DNA 分子质量标准和单个酶切基因组 DNA 的凝胶栓。将制备样品加入制备槽。
3. 电泳结束后，切下含有分子质量标准和单个基因组 DNA 栓的泳道，室温溴化乙锭或 SYBR Gold 染色 30 min。如果需要可以水中脱色 30 min。不要染制备泳道。
4. 紫外照射检查染色切片，在切片目的 DNA 的侧面做上刻痕标记。
5. 重新把染过色的分子质量标准和单个栓的凝胶组合起来，将未染色的制备泳道中的目的 DNA 大致定位。仔细地用干净剃刀割下这个区域，把凝胶切片转移到带盖聚丙烯管中。长期贮存，片段应置于 4℃ 密封管中。点印迹或 Southern 印迹可以更精确地获得制备胶中目的片段的定位（van de Pol et al.，1990)。
6. 琼脂糖酶缓冲液覆盖凝胶片段，室温温育 1 h, 其间偶尔振动。倒去缓冲液，重复操作 2 次。
7. 更换完缓冲液后，65~68℃ 熔化含有 DNA 片段的琼脂糖切片。熔化时旋转小管以确保熔化完全。
8. 溶解的胶中加入适当量的琼脂糖酶。建议在厂家推荐的温度下消化凝胶。
9. 消化后，加热使琼脂糖酶失活或通过酚: 氯仿抽提将酶除去。
1. 缓冲液和溶液
溴化乙锭 ( 1 μg/ml ) 或适当稀释度的 SYBR Gold
酚：氯仿（1:1, V/V) ( 可任意选择的）
2. 核酸和寡核苷酸
DNA 大小标准
低熔点琼脂糖栓包埋的基因组 DNA
3. 专用设备
设置 65~68℃ 及琼脂糖酶消化的适宜温度的水浴
二、方法
1. 准备制备用低熔点琼脂糖 PFGE, 它将提供分离目的 DNA 片段的最佳分辨率。
2. 制备槽的两侧加样孔分别加入 DNA 分子质量标准和单个酶切基因组 DNA 的凝胶栓。将制备样品加入制备槽。
3. 电泳结束后，切下含有分子质量标准和单个基因组 DNA 栓的泳道，室温溴化乙锭或 SYBR Gold 染色 30 min。如果需要可以水中脱色 30 min。不要染制备泳道。
4. 紫外照射检查染色切片，在切片目的 DNA 的侧面做上刻痕标记。
5. 重新把染过色的分子质量标准和单个栓的凝胶组合起来，将未染色的制备泳道中的目的 DNA 大致定位。仔细地用干净剃刀割下这个区域，把凝胶切片转移到带盖聚丙烯管中。长期贮存，片段应置于 4℃ 密封管中。点印迹或 Southern 印迹可以更精确地获得制备胶中目的片段的定位（van de Pol et al.，1990)。
6. 琼脂糖酶缓冲液覆盖凝胶片段，室温温育 1 h, 其间偶尔振动。倒去缓冲液，重复操作 2 次。
7. 更换完缓冲液后，65~68℃ 熔化含有 DNA 片段的琼脂糖切片。熔化时旋转小管以确保熔化完全。
8. 溶解的胶中加入适当量的琼脂糖酶。建议在厂家推荐的温度下消化凝胶。
9. 消化后，加热使琼脂糖酶失活或通过酚: 氯仿抽提将酶除去。
来源：丁香实验
