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从琼脂糖凝胶(Agaros gel)中回收DNA片段

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一、实验原理

限制性内切酶切割后的DNA片断经过电泳后,按分子量大小被分开,排列在琼脂糖凝胶中,可以将特定的某条DNA带所在的凝胶切下来,加热或用特殊的试剂熔解凝胶,使DNA溶回到溶液中,再经过乙醇沉淀或过柱即可获得目的 DNA酶切片段。

二、实验试剂

1. 电泳缓冲液

2. 荧光染料

3. 电泳级琼脂糖粉

4. 10′加样缓冲液

5. DNA分子量标准(DL2000)

6. DNA凝胶回收试剂盒

三、实验设备

1. 旋涡混合器

2. 微量移液取样器

3. 移液器吸头

4. 1.5 ml 微量离心管

5. 双面微量离心管架

6. 台式离心机

7. 琼脂糖凝胶电泳系统

8. 微波炉

9. 恒温水浴

四、实验步骤

1. 配制TAE电泳缓冲液(10′储存液),10′加样缓冲液,1.5 ml离心管装入铝制饭盒(灭菌)、移液器吸头装入相应的吸头盒(灭菌)。

2. 操作步骤

(1)用1′TAE配制1%琼脂糖凝胶。DNA用合适的酶切。

(2)在胶上选定两个加样孔,分别加入少量(10 μl)和大量(50 μl )DNA酶切产物,电泳。

(3) 电泳结束后用刀片切下含有少量DNA酶切产物的泳道(一般选择位于凝胶的边缘),在紫外灯下找到目的DNA 带,用刀片切在带的下上下边缘各切一个小口作为标记。注意:含有大量DNA酶切产物的凝胶既不用加荧光染料,也不用紫外灯照射!

(4)将做好标记的凝胶条与未染色的凝胶原位对齐,根据小胶条上的标记估计未染色的大胶上DNA酶切产物的位置,用刀片切下大胶中DNA产物所在的凝胶(尽量不要多余的凝胶),转移至一个称量过的干净的1.5ml微量离心管中。再称量后计算出胶的重量。

(5)按照DNA快速纯化/回收试剂盒操作说明,纯化回收目的片段。

纯化/回收试剂盒组成:

溶液A:6 M NaClO4,0.03 M NaAc,pH5.2,少量酚红;

溶液B:3 M NaAc;

溶液C:用时加入35 ml无水乙醇;

溶液D:TE缓冲液。

胶回收步骤如下:

a. 将切下的胶带放入1.5 ml离心管中,按照1:3 (胶带重量:溶液A的体积)的比例加入溶液A;

b. 50℃水溶10 min,胶带完全要求完全溶化,其间可振荡助溶2~3次,待溶化后置室温加入15 μl溶液B,充分混匀;

c. 将溶液置于离心柱中,静置2 min,10 000 rpm离心20 s;

d. 倒掉液体,加入500 μl溶液C于离心柱中10 000 rpm离心20 s,弃液体,重复该步骤一次;

e. 12 000 rpm离心1 min,甩干剩余液体以除去残余乙醇;

f. 将离心柱置于新的离心管中,室温敞开离心管盖放置5~10 min,使乙醇挥发殆尽;

g. 加入20~30 μl溶液D(使用前50℃水浴),静置2 min;

h. 12 000 rpm离心1 min,管底溶液即为所需DNA,将DNA贮存于-20℃可长期保存。

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