【资源】实验六 从琼脂糖凝胶中回收DNA片段
丁香园论坛
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1．目的
学会从琼脂糖凝胶中回收DNA片段的基本技术。
2．原理
限制性内切酶切割后的DNA片断经过电泳后，按分子量大小被分开，排列在琼脂糖凝胶中，可以将特定的某条DNA带所在的凝胶切下来，加热或用特殊的试剂熔解凝胶，使DNA溶回到溶液中，再经过乙醇沉淀或过柱即可获得目的DNA酶切片段。
3．器材
旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面微量离心管架，台式离心机，琼脂糖凝胶电泳系统，微波炉，水漂，恒温水浴。
4．试剂
电泳缓冲液，荧光染料，电泳级琼脂糖粉，10´加样缓冲液，DNA分子量标准（DL2000），DNA凝胶回收试剂盒。
5．实验准备
配制TAE电泳缓冲液（10´储存液），10´加样缓冲液，1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）；
6．操作步骤
（1）用1´TAE配制1%琼脂糖凝胶。DNA用合适的酶切。
（2）在胶上选定两个加样孔，分别加入少量（10μl）和大量（50μl ）DNA酶切产物，电泳。
（3）电泳结束后用刀片切下含有少量DNA酶切产物的泳道（一般选择位于凝胶的边缘），在紫外灯下找到目的DNA带，用刀片切在带的下上下边缘各切一个小口作为标记。注意：含有大量DNA酶切产物的凝胶既不用加荧光染料，也不用紫外灯照射！
（4）将做好标记的凝胶条与未染色的凝胶原位对齐，根据小胶条上的标记估计未染色的大胶上DNA酶切产物的位置，用刀片切下大胶中DNA产物所在的凝胶（尽量不要多余的凝胶），转移至一个称量过的干净的1.5ml微量离心管中。再称量后计算出胶的重量。
（5）按照北京鼎国生物技术有限公司生产的DNA快速纯化/回收试剂盒操作说明，纯化回收目的片段。
纯化/回收试剂盒组成：
溶液A：6M NaClO4，0.03M NaAc，pH5.2，少量酚红；
溶液B：3M NaAc；
溶液C：用时加入35ml无水乙醇；
溶液D：TE缓冲液。
胶回收步骤如下：
① 将切下的胶带放入1.5ml离心管中，按照1：3 (胶带重量：溶液A的体积)的比例加入溶液A；
② 50℃水溶10min，胶带完全要求完全溶化，其间可振荡助溶2～3次，待溶化后置室温加入15μl溶液B，充分混匀；
③ 将溶液置于离心柱中，静置2min，10000rpm离心20s；
④ 倒掉液体，加入500μl溶液C于离心柱中10000rpm离心20s，弃液体，重复该步骤一次；
⑤ 12000rpm离心1min，甩干剩余液体以除去残余乙醇；
⑥ 将离心柱置于新的离心管中，室温敞开离心管盖放置5～10min，使乙醇挥发殆尽；
⑦ 加入20～30μl溶液D(使用前50℃水浴)，静置2min；
⑧ 12000rpm离心1min，管底溶液即为所需DNA，将DNA贮存于-20℃可长期保存。
（6）清理桌面，撰写实验报告。
7．思考
（1）为何避免用荧光染料染色和用紫外灯照射目的DNA？
学会从琼脂糖凝胶中回收DNA片段的基本技术。
2．原理
限制性内切酶切割后的DNA片断经过电泳后，按分子量大小被分开，排列在琼脂糖凝胶中，可以将特定的某条DNA带所在的凝胶切下来，加热或用特殊的试剂熔解凝胶，使DNA溶回到溶液中，再经过乙醇沉淀或过柱即可获得目的DNA酶切片段。
3．器材
旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面微量离心管架，台式离心机，琼脂糖凝胶电泳系统，微波炉，水漂，恒温水浴。
4．试剂
电泳缓冲液，荧光染料，电泳级琼脂糖粉，10´加样缓冲液，DNA分子量标准（DL2000），DNA凝胶回收试剂盒。
5．实验准备
配制TAE电泳缓冲液（10´储存液），10´加样缓冲液，1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）；
6．操作步骤
（1）用1´TAE配制1%琼脂糖凝胶。DNA用合适的酶切。
（2）在胶上选定两个加样孔，分别加入少量（10μl）和大量（50μl ）DNA酶切产物，电泳。
（3）电泳结束后用刀片切下含有少量DNA酶切产物的泳道（一般选择位于凝胶的边缘），在紫外灯下找到目的DNA带，用刀片切在带的下上下边缘各切一个小口作为标记。注意：含有大量DNA酶切产物的凝胶既不用加荧光染料，也不用紫外灯照射！
（4）将做好标记的凝胶条与未染色的凝胶原位对齐，根据小胶条上的标记估计未染色的大胶上DNA酶切产物的位置，用刀片切下大胶中DNA产物所在的凝胶（尽量不要多余的凝胶），转移至一个称量过的干净的1.5ml微量离心管中。再称量后计算出胶的重量。
（5）按照北京鼎国生物技术有限公司生产的DNA快速纯化/回收试剂盒操作说明，纯化回收目的片段。
纯化/回收试剂盒组成：
溶液A：6M NaClO4，0.03M NaAc，pH5.2，少量酚红；
溶液B：3M NaAc；
溶液C：用时加入35ml无水乙醇；
溶液D：TE缓冲液。
胶回收步骤如下：
① 将切下的胶带放入1.5ml离心管中，按照1：3 (胶带重量：溶液A的体积)的比例加入溶液A；
② 50℃水溶10min，胶带完全要求完全溶化，其间可振荡助溶2～3次，待溶化后置室温加入15μl溶液B，充分混匀；
③ 将溶液置于离心柱中，静置2min，10000rpm离心20s；
④ 倒掉液体，加入500μl溶液C于离心柱中10000rpm离心20s，弃液体，重复该步骤一次；
⑤ 12000rpm离心1min，甩干剩余液体以除去残余乙醇；
⑥ 将离心柱置于新的离心管中，室温敞开离心管盖放置5～10min，使乙醇挥发殆尽；
⑦ 加入20～30μl溶液D(使用前50℃水浴)，静置2min；
⑧ 12000rpm离心1min，管底溶液即为所需DNA，将DNA贮存于-20℃可长期保存。
（6）清理桌面，撰写实验报告。
7．思考
（1）为何避免用荧光染料染色和用紫外灯照射目的DNA？
