从琼脂糖中凝胶中回收DNA片段的技术

相关专题

DNA连接与转化

从琼脂 糖中回收DNA片段

实验目的：

掌握从琼脂糖凝胶中回收DNA片段的技术。

DNA片段的胶回收：

电泳洗脱法

低熔点琼脂糖凝胶电泳 挖块法

冻融回收法

玻璃奶回收法

柱回收法(按说明书进行)

胶回收注意事项：

将电泳槽 用ddH2O反复清洗干净，倒入新鲜配制的灭菌电泳缓冲液;

根据点样量制备合适厚度的琼脂糖凝胶板;

切胶时尽可能切掉不含DNA片段的凝胶;

要尽量减少DNA在紫外下的照射时间以减少对DNA的损伤;

熔胶要完全。

目的基因片段与载体 连接

实验目的：掌握DNA片段的体外连接技术。

DNA连接 酶：

能催化双链DNA片段紧靠在一起的5’-P末端和3’-OH末端之间形成磷酸二酯键，使两末端连接。

E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶

1、E.coli DNA连接酶：

由E.coli基因lig编码，需烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NAD+)作为辅助因子。

修复双链DNA上的单链缺刻(nick)，用于连接匹配粘端。

2、T4 DNA连接酶：

从T4噬菌体感染的E.coli中分离得到，由T4基因DNA30编码，需ATP作为辅助因子。

修复双链DNA上的单链缺刻(nick)，用于连接匹配粘端;

连接RNA-DNA杂交双链上DNA链缺刻;

连接平端双链DNA分子 。

1、修复双链DNA上的单链缺刻，用于连接匹配粘端。

带匹配粘端的DNA分子靠近时，自发形成暂时的碱基配对，利于连接酶把紧邻的5’-P与3’-OH连接到一起。

不同DNA片断通过匹配粘端的连接。

同一DNA片断通过匹配粘端的连接--自身环化。

2、连接RNA-DNA杂交双链中DNA链上的缺刻。

3、连接带平端的双链DNA分子。

注意：

DNA连接酶不能催化两单链DNA分子连接;

只能连接双链DNA分子的单链缺刻(nick);

不能连接双链中1个或多个核苷酸缺失所致的缺口(gap)。

E.coli DNA连接酶：连接匹配粘端;

T4 DNA连接酶：连接匹配粘端、平端。

最常用的为T4 DNA连接酶。

匹配粘端的连接：

1)哪些情况下会产生匹配粘端?

同一限制酶切割产生;

同尾酶切割产生。

2)可以用E.coli DNA连接酶、也可以用T4 DNA连接酶。

3)连接效率高。

4)连接后的情况如何?

同一限制酶切割的DNA片段，连接后仍保留该限制酶的识别序列。

两种同尾酶切割的DNA片段，连接后丧失这两种限制酶的识别序列。

平端的连接：

1)哪些情况下会产生平端?

限制酶切割产生;

RNA逆转录 合成的cDNA为平端双链;

PCR 扩增也能产生，如用Pfu扩增时。

2)只能用T4 DNA连接酶。

3)连接效率低，仅为粘端的1%。

4)连接后的情况如何?

同一限制酶切割的DNA片段，连接后仍保留该限制酶的识别序列，有时还出现另一种新的限制酶识别序列。

不同限制酶切割的DNA片段，连接后丧失这两种限制酶的识别序列。

提高平端连接效率的方法

加大连接酶用量(10倍于粘端连接，1-2U);

加大平端DNA片段的浓度;

加入10% PEG 8000;

加入单价阳离子(NaCl)，终浓度150-200 mM。