目的基因片段的PCR扩增与克隆
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PolymeraseChainReaction聚合酶链反应
它是一种模拟天然DNA复制过程，在有DNA模板、DNA聚合酶（Taq酶）、RNA引物和四种dNTP的情况下，通过高温变性（90℃－95℃，1－2min）,低温退火（25℃－37℃，1－2min）,中温延伸（60℃－75℃，90sec-5min）,这样反复循环的过程中，在体外扩增特异性DNA片段的分子生物学技术。
1）、PCR反应成分：
TaqDNA聚合酶
引物浓度：一般0.1-0.5μmol/L
dNTP:一般为50－200μmol/L
Mg2+
模板：PCR对模板的要求不高，单、双链DNA均可，但样品中不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂以及能与DNA结合的蛋白质。
添加剂：DMSO（二甲基亚枫），提高扩增效率及特异性
（1）理论上PCR合成产物的数量经过每轮循环都将增加一倍，应按2n的指数方式递增，PCR反应30轮循环后，PCR扩增应达到230个拷贝，约109个拷贝。但由于DNA聚合酶的质量、待扩增片段的序列及反应系统的条件等各种因素的影响，实际扩增效率比预期的要低，一般可达106－107个拷贝
平台效应”：PCR反应中，当引物－模板与DNA聚合酶达到一定比值时，DNA聚合酶催化反应趋于饱和，即PCR反应不再增加。平台效应在PCR反应中是不可避免的，但一般在平台效应出现前，PCR产物的数量足以满足实验的需要。
（2）PCR反应条件的优化
PCR方法操作简便，但影响因素颇多，因此需要根据不同的DNA模板，摸索最适条件。主要从：
反应的特异性、敏感性、真实性、扩增效率等四个方面衡量PCR反应的结果。
①循环参数 变性 退火 延伸
②PCR反应成分
（3）PCR反应引物的设计
引物的设计在整个PCR扩增中占有十分重要的地位。
①引物的序列应位于基因组DNA的高度保守区，且与非扩增区无同源序列。这样可以减少引物与基因组的非特异性结合，提高反应的特异性
②引物长度：15－40bp为宜。引物过短或过长均可使反应的特异性下降。
③引物的碱基尽可能随机发布，避免出现数个嘌呤或嘧啶的连续排列，G+C碱基的含量在40%－75%之间。
④引物内部应避免形成二级结构，特别是引物的末端应避免有回文结构。
⑤二个引物不应有互补序列，特别是3’端应避免互补，以免形成“引物二聚体”，浪费引物。
⑥引物5’末端碱基无严格限制，在与模板DNA结合的引物长度足够的条件下，其5’端碱基可不与模板DNA互补而呈游离状态，因此可在引物5’端加上限制性内切酶位点、启动子序列或其它序列等以便于PCR产物的分析克隆等，引物的5’端最多可加10个碱基而对PCR反应无影响。
PCR反应系统总体积10 μl，模板DNA的量为植物总DNA 10 ng。
PCR反应体系(10 μl)
各对引物的复性温度不一样，用x代替。延伸时间用y代替，其中片断长度如果大于1kb，y为1.5 min；大于2kb，y为2.0 min；片断长度如果小于1kb，y为1 min。扩增按如下程序进行：
step1 94℃ 5 min 预变性
step2 94℃ 1 min 变性
step3 X℃ 1 min 复性
step4 72℃ y min 延伸
step5 GO TO step2 30循环
step6 72℃ 10 min 延伸
step7 4℃ 10 min 保温
step8 End
扩增产物于0.8%的琼脂糖凝胶80伏电泳2 h，溴乙锭染色，凝胶成像仪观察分析扩增结果。若扩增谱带明显，并具有特异性，则挖带进行进一步扩增；若扩增谱带不明显，或特异性较差，则改变PCR条件，直到扩增出特异谱带。
凝胶加样缓冲液：0.25%溴酚兰；0.25%二甲苯青FF；40%（w/v）蔗糖水溶液；1×TAE
在琼脂糖凝胶中溴酚兰相当于35bp，二甲苯青相当于130bp。
目的DNA片段的进一步扩增
1 在长波紫外灯下切取特异的扩增谱带
2 将挖取的琼脂糖凝胶置于1.5ml Eppendorf管中，加50µl TE，用枪头捣碎凝胶后于45℃水浴30min。
3 离心5分钟后，取上清夜继续进行PCR，反应条件同第一次PCR。
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体系各成分 |
用 量(μL) |
|
10×Taq buffer |
5.0 |
|
引物1(20p mol L-1) |
1.0 |
|
引物2(20pmol/μL) |
1.0 |
|
MgCl2(25m mol L-1) |
5.0 |
|
4dNTP(2.5m mol L-1) |
5.0 |
|
Template DNA |
32.5 |
|
Taq酶(3U) |
0.5 |
|
总体积 |
50 |
2．用E.Z.N.A.GelExtractionKit进行回收
a)用0.8%琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，在紫外灯下切取目的片段，放入Eppendorf管。并称重。
b)每管加入等体积的Bindingsolution(约100μl/0.1g)，60℃水浴7min至凝胶完全融化，其间温和地混合几次。
c)在Hind®DNAspin中加入700μlDNA/琼脂糖混合液。室温下，10,000rpm，离心3min，去上清。若DNA/琼脂糖混合液体积大于700μl，每次取700μl，连续装柱、离心。(注：每柱最多回收25~30μgDNA)
d)加入300μlBindingbuffer，室温下，10,000rpm离心10min，弃上清。
e)每管加入700μl的无水乙醇稀释的spwbuffer到柱中，静置3min，室温下，10,000rpm离心1min。
f)弃上清，10,000rpm离心空管1min。
g)转移柱至一个干净的1.5ml离心管中，每管加20μlDNAElutionbuffer，室温下，10,000rpm离心1min。上清夜即为纯化的DNA片段。
3.目的片段的克隆
纯化的片段连接到克隆载体pGEM-Tvector，转化导入宿主菌E.coliDH5α，通过蓝白斑筛选，PCR扩增鉴定后测序，获得的含所需要的目的片段的质粒。
（1）pGEM®-TEasy载体系统
I.描述
pGEM®-TEasy载体系统可用于PCR产物的克隆。这种载体是通过EcoRⅤ酶切pGEM®-5Zf(+)和pGEM®-TEasy载体，并在3’末端加入胸腺嘧啶构建的。插入位点3’-T突出端可提高PCR产物的连接效率，因为3’-T突出端可以防止载体的自身环化，并且为热稳定性聚合酶（1，2）产生PCR产物提供一个匹配碱基。如表1总结的，这些聚合酶常常以不依赖模板方式在扩增产物的3’端加上一个脱氧腺苷酸（3，4）。pGEM®-TEasy高拷贝数载体包含有T7和SP6RNA聚合酶启动子，其侧翼和多克隆位点区相接，多克隆位点区位于β半乳糖苷酶的α肽编码区内。α肽插入失活允许在指示培养基用颜色直接筛选重组克隆。另外这两个载体的多克隆位点区的限制性酶切位点适用于采用Promega公司Erase-a-Base®系统（产品目录号#E5750）产生一系列巢式缺失体。
pGEM®-TEasy载体的多克隆位点区含有一些这样的限制性酶切位点，采用这些酶进行单酶切消化即可释放插入片段。如pGEM®-TEasy载体多克隆区的EcoRⅠ、BstZⅠ和NotⅠ酶切位点。这种载体也可选用适当的双酶切消化释放插入片段。
pGEM®-TEasy载体含有丝状噬菌体f1复制起始子，可用于制备单链DNA(ssDNA参见第Ⅶ部分)。单链DNA分子对应于图1底部一条链，代表pGEM®-TEasy载体。
pGEM®-TEasy载体系统包含2×快速连接缓冲液，用于连接PCR产物。采用这种缓冲液进行连接，在室温孵育1小时即可完成。延长孵育时间可增加转化克隆菌数目。一般4℃过夜连接可产生最多的转化子。
表1.部分热稳定性DNA聚合酶所产生的PCR产物特性的比较。
热稳定性DNA聚合酶
|
特性 |
Taq/ AmpliTaq® |
Tfl |
Tth |
Vent®/(Tli) |
Deep Vent® |
Pfu |
Pwo |
|
PCR 产物末端 |
3’A |
3’A |
3’A |
>95%平端 |
>95%平端 |
平端 |
平端 |
|
5’-3’外切酶活力 |
有 |
有 |
有 |
无 |
无 |
无 |
无 |
|
3’-5’外切酶活力 |
无 |
无 |
无 |
有 |
有 |
有 |
有 |
II. 载体图谱
GEM®-T Easy 载体的启动子及多克隆位点区序列 。上部序列链对应于用T7 RNA 聚合酶合成的RNA 序列，底部序列链对应于用SP6 RNA 聚合酶合成的RNA 序列。
pGEM®-T Easy 载体环形图谱及相关的序列位点
pGEM®-TEasy载体相关的序列位点：
T7RNA聚合酶转录起始位点1
多克隆位点区10－128
SP6RNA聚合酶启动子（－17至＋3）139－158
SP6RNA聚合酶转录起始位点141
pUC/M13反向测序引物结合位点176－197
lacZ起始密码子180
lac操纵子200－216
β内酰胺酶编码区1337－2197
噬菌体f1区2380－2835
lac操作子序列2836－2996,166－395
pUC/M13正向测序引物结合位点2956－2972
T7RNA聚合酶启动子（－17至＋3）2999－3
（2）目的片段与T载体的连接和转化
采用PromegaT载体克隆试剂盒（pGEM-TEasySystemIkit）进行DNA片段克隆，具体步骤如下：
1）按下表混合各反应成分；
T载体连接反应体系
|
试剂 |
标准反应 |
阳性对照 |
空白对照 |
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10×T4连接缓冲液 |
0.5µl |
0.5µl |
0.5µl |
|
pGEM-T载体（50mg/ml） |
0.5µl |
0.5µl |
0.5µl |
|
PCR产物（回收） |
2.5µl |
―― |
―― |
|
阳性对照 |
―― |
1µl |
―― |
|
T4-DNA连接酶（3U/µl） |
0.5µl |
0.5µl |
0.5µl |
|
dd H2O |
1µl |
2.5µl |
3.5µl |
|
总体积 |
5µl |
5µl |
5µl |
2）4℃，连接过夜；
3）每个连接反应准备两个含氨苄青霉素的LB培养基，使用前半小时均匀涂布IPTG和X-Gal在平板表面；
4）将感受态细胞放入冰盒中，解冻后迅速加入2μl待转化的质粒DNA溶液，混匀。
5）在超净工作台上取950μl37℃预热的LB到最小的锥形瓶中，迅速拿到电转化仪旁。
6）将菌液靠壁全部加入电转化杯中，在桌面上敲两下。设置电击参数：
7）1,300V，5ms，按下start开始电击。迅速取出电击菌液，将预热好的LB加入，用枪将槽中菌液轻打混匀，并将所有菌液全部转入5ml管中，
迅速置于37℃摇床，150rpm，培养1小时。
8）取菌液50~100μl涂布在含氨苄青霉素、IPTG和X-Gal的LB平板上，37℃培养过夜，筛选转化子。注意要设空白，及质粒DNA对照。
（3）克隆片段的检测－1
1）在LB平板上挑取白色单菌落，置于2ml含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养12-16小时；
2）4℃、12,000rpm离心30秒，收集细胞沉淀；
3）碱裂解法提取并纯化质粒DNA；
①将细菌沉淀，菌体重悬于100µl用冰预冷的溶液I中，剧烈振荡；
②加新配制的溶液II200µl，盖紧管盖，迅速颠倒混匀，将离心管放置于冰上；
③加150µl用冰预冷的溶液III，盖紧管口，将管倒置后温和地振荡10秒，使溶液III在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上3-5分钟；
④用微量离心机于4℃、12,000rpm离心5分钟，将上清液移到另一离心管中；
⑤加等量酚：氯仿（V/V），振荡均匀，用微量离心机于4℃、12,000rpm离心2分钟，将上清液转移到另一离心管中；
⑥用2倍体积的乙醇沉淀双链DNA；
⑦用微量离心机于4℃、12,000rpm离心5分钟；
⑧小心吸取上清液，将离心管倒置于吸水纸上，使其中液体流尽；
⑨用1ml75%乙醇洗沉淀的DNA，在空气中干燥10分钟，加入适量TEbuffer（10-20µl）溶解；
（溶液I、溶液II、溶液III的配制见表9）
质粒DNA的提取试剂
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溶液I |
溶液II |
溶液III |
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50mmol/L 葡萄糖 |
0.2mol/L NaOH （用前配制） |
5mol/L乙酸钾（60ml） |
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25mmol/L Tris.HCl（PH8.0） |
1％SDS |
冰乙酸（11.5ml） |
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10mmol/L EDTA (PH8.0) |
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蒸馏水（28.5ml） |
4 插入片段检测：
以相应的插入片段的PCR引物对抽提的质粒DNA进行扩增（条件与第一次PCR相同），然后在0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测是否有目的插入片段及插入片段大小。
