目的基因片段的回收

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6.1实验原理
DNA片段的分离与回收是基因工程 操作中一项重要的技术，如可收集特定酶切片段用于基因克隆或是制备探针，回收PCR产物用于再次鉴定等。理想的DNA片段回收方法应满足以下几个要求：
（1）回收片段应有非常高的纯度
如从普通凝胶中分离出来的片段不可带有即使是微量的凝胶――凝胶会抑制大部分的酶活力，对于后续DNA片段用于再酶切分析或连接均是不利的。
（2）回收过程必须是严格的无DNA酶污染的操作过程
衡量的Dnase均可能使回收的目的DNA片段降解，当降解作用仅发生在粘性末端时，在凝胶电泳中是无法看到回收的DNA片段有任何差异，但会导致DNA连接 实验的失败，最终影响后续的克隆实验。
（3）能回收不同大小的DNA片段
对于采用的回收方法必须能对不同大小的DNA片段均能回收，当回收大片段时不发生机械性损伤与断裂作用，造成大片段断裂。
（4）回收效率要高
回收方法要能对微量DNA也能进行操作，也即回收效率相对要较高，则对于实验中获得的非常微量的DNA样品也可进行分析。
（5）操作简单、快速
在回收过程中一般不需特殊的实验设备，也不需要昂贵的试剂，并且操作时间较短，象现在常用的试剂盒回收在电泳完成后整个回收过程只需30min左右，并且样品的回收率可达50％。
6.1.1各类常用回收方法
由于分离方法众多，且各种不同的方法可能同时依据多项原理，所以只能粗略地将各种方法分成五大类：电泳法、收集孔法、机械破碎法、溶（熔）胶法与酶处理法：
一、电泳法
根据凝胶割否分透析袋法与流动电洗脱法（割胶），滤纸-透析膜法与DEAE膜法（不割胶）。
（1）透析袋法
该方法可回收大于5kb的片段，缺点是操作麻烦并易造成DNA酶的污染。
（2）流动电洗脱法
该方法回收片段大小为4～50kb，且回收效率高达94～100％，极端条件下可回收大至550kb的片段。缺点是操作繁琐，而且为了取得较高的回收率，需特定的流动电洗脱槽。
（3）滤纸-透析膜法
回收率平均达70％左右，不需割胶，操作相对简单，但实验中需将滤纸上的DNA洗脱，也较繁琐，也不易控制。
（4）滤纸-透析膜法
此方法用于回收小片段，一般小于5kb的片段回收效率较高，可达70％以上；对于大片段（>15kb）则难以从DEAE膜上洗脱下。
二、收集孔法
（1）蔗糖法
回收小片段效率较高，564bp的PCR 产物带回收效率高达97.6%，并且回收中能将较宽的条带浓缩于收集孔中，但回收中制作收集孔较麻烦，并且收集孔中要加入蔗糖，故获得的DNA样品不能直接用于后续实验。
（2）羟基磷灰石法
该方法回收效率也较高，不利之处与上述方法相同，获得的DNA需再纯化，操作也较繁琐。
三、机械破碎法
指用机械力将凝胶压碎后再行回收DNA片段，有冻挤法，冻融法、压碎浸泡法、（单层）滤膜过滤法及双层（亲和）膜过滤法。
（1）冻挤法
将胶条割下置于塞有玻璃棉的吸嘴或是管底刺有小孔的eppendorf管中，冰冻30min后全速离心5min，收集清液，再经酚抽提、乙醇沉淀等纯化浓缩处理（也可直接沉淀）。其基本原理理是利用离心力将凝胶中原有的液体挤出，同时也带出胶中的DNA。从胶浓度为1%琼脂 糖中回收650bp、1.1kb、2.0kb、4.5kb的片段时，回收率分别为90％、74％、56％、30％。这是因为大分子DNA更难于被胶中的缓冲液带出，所以此法只适用于回收较小的DNA片段。
（2）冻融法
割下的胶条放在eppendorf 管中，将之捣碎并放于-80℃冰冻5min，取出后迅速放置于37℃保温10min，如此反复3次能使DNA从胶中游离出来，离心获得上清中即含有目的DNA，可通过沉淀浓缩获得高浓度。对一般的DNA片段回收效率在60～80%。操作简单，并不需特殊设备。
（3）压碎浸泡法
又称醋酸铵法，操作较费时，回收效率较低，一般改良的方法是在冻挤法操作中，加入一定的水并浸泡10min，增加DNA的回收率。